El principio de Coulter (1954-1955)

Estando bajo contrato con la Marina de los Estados Unidos a finales de los años 40, Wallace H. Coulter desarrolló una tecnología para el recuento y la medición de las partículas utilizando mediciones de impedancia. La tecnología se desarrolló principalmente para contar con rapidez las células sanguíneas midiendo los cambios en la conductancia eléctrica a medida que las células suspendidas en un fluido conductor atravesaban un pequeño orificio. En la actualidad, más del 98 % de los contadores de células automatizados incorporan esta tecnología, que se conoce como el principio de Coulter. En los últimos setenta y cinco años, también se ha utilizado la tecnología para caracterizar miles de materiales particulados industriales diferentes.Esquema de un contador Coulter

Los sistemas de instrumentos de Beckman Coulter que utilizan este principio se denominan instrumentos COULTER COUNTER. Fármacos, pigmentos, rellenos, tóneres, alimentos, abrasivos, explosivos, arcilla, minerales, materiales de construcción, materiales de revestimiento, metales, materiales de filtro y muchos otros tipos de muestras se han analizado con el principio de Coulter. Este método se puede utilizar para medir cualquier materia particulada que se pueda suspender en una solución de electrolitos. Se pueden medir de forma rutinaria partículas tan pequeñas como 0,4 µm y tan grandes como 1600 µm de diámetro. Se han documentado más de 8.000 referencias en cuento a los usos de esta tecnología.

En un instrumento COULTER COUNTER, se sumerge un tubo con una pequeña abertura en la pared en un vaso de precipitación que contiene partículas suspendidas en un electrolito de baja concentración. Se colocan dos electrodos, uno dentro del tubo en la apertura y otro fuera del tubo pero dentro del vaso de precipitación, y el electrolito proporciona una trayectoria de corriente al aplicar un campo eléctrico (Figura 1). A continuación se mide la impedancia entre los electrodos. La abertura crea lo que se denomina "zona de detección". Las partículas en baja concentración suspendidas en el electrolito se pueden contar haciéndolas pasar por la abertura. Una partícula, al pasar por la abertura, desplaza de la zona de detección un volumen de electrolito equivalente al volumen sumergido de la partícula. Esto provoca un cambio a corto plazo en la impedancia a través de la abertura. Este cambio se puede medir como un pulso de voltaje o de corriente. La altura del pulso es proporcional al volumen de la partícula detectada. Si se asume una densidad de partículas constante, la altura del pulso también es proporcional a la masa de la partícula. Esta tecnología también se denomina tecnología de apertura.

Utilizando circuitos analizadores de recuento y de altura de pulso, se puede medir la cantidad de partículas que pasan por la abertura y el volumen de cada una de ellas. Si el volumen de líquido que pasa por la abertura se puede controlar y medir con precisión, también se puede determinar la concentración de la muestra. En los instrumentos COULTER COUNTER modernos, como los Multisizer™ 3 y 4, los contadores de partículas y los instrumentos de medición, las pulsos se digitalizan y guardan con varios parámetros clave que describen cada pulso, como la altura, la anchura y el área del pulso, la marca de tiempo, etc. Estos parámetros permiten al instrumento una mejor discriminación entre el ruido y los pulsos reales, así como entre los pulsos normales y los distorsionados debidos a diversas razones cuando las partículas atraviesan la abertura. Los pulsos guardados se pueden utilizar para monitorizar los cambios de la muestra durante el período de medición en el caso de que los pulsos se organicen en secuencia temporal. En la práctica, el volumen de las partículas suele representarse en términos de diámetro esférico equivalente. El volumen (o tamaño) medido de las partículas puede utilizarse luego para obtener la distribución del tamaño de las partículas.

Con tasas de recuento y medición de hasta 10.000 partículas por segundo, con un instrumento COULTER COUNTER se tarda menos de un minuto en realizar una medición típica. La precisión de las mediciones de tamaño puede ser mejor que 1 %. El tamaño de la abertura suele oscilar entre 20 y 2000 µm. Cada abertura puede utilizarse para medir partículas dentro de un intervalo de tamaño del 2 a 80 % del diámetro nominal. Por lo tanto, es posible un intervalo de tamaño de partícula general de 0,4-1600 µm. Sin embargo, la capacidad de la tecnología para analizar las partículas se limita a aquellas partículas que puedan suspenderse adecuadamente en una solución de electrolitos. Por lo tanto, el límite superior podría ser de 500 µm para arena, pero solo de 75 µm para partículas de carburo de tungsteno. Además, el límite de tamaño inferior viene restringido por el ruido electrónico generado principalmente dentro de la propia apertura. La selección del tamaño de abertura más adecuado depende de las partículas que se vayan a medir. Si la muestra que se va a medir está compuesta de partículas en gran parte dentro de un intervalo de tamaño de 30:1 de diámetro, se puede elegir la apertura más adecuada. Por ejemplo, una abertura de 30 µm puede medir partículas de aproximadamente 0,6 a 18 µm de diámetro. Una abertura de 140 µm puede medir partículas de aproximadamente 2,8 a 84 µm. Si las partículas que se van a medir cubren un intervalo más amplio que el que puede medir una sola abertura, se deben utilizar dos o más aberturas y los resultados de la prueba se pueden superponer para proporcionar una completa distribución del tamaño de las partículas.

La resolución más alta para el análisis de tamaño de partícula

El principio de CoulterDurante la medición por el principio de Coulter, a medida que una partícula pasa por la zona de detección al extraerse el líquido del recipiente, se desplaza de la zona de detección un volumen de electrolito equivalente al volumen sumergido de la partícula. Esto provoca un cambio a corto plazo de la resistencia a través de la abertura. Esta resistencia se puede medir como un pulso de voltaje o de corriente. Al medir el número de pulsos y sus amplitudes, se puede obtener información sobre el número de partículas y el volumen de cada partícula individual.

El número de pulsos detectados durante la medición es el número de partículas medidas, y la amplitud del pulso es proporcional al volumen de la partícula. Dado que se trata de un proceso de medición de una sola partícula, produce la mayor resolución que ninguna otra técnica de caracterización de partículas puede lograr. El diámetro de la partícula se puede determinar con la resolución de la medición del voltaje o la corriente, que puede ser muy precisa utilizando la tecnología electrónica actual. La amplitud de la distribución se puede determinar a la precisión de una sola partícula.

Las ventajas de dicha alta resolución son múltiples, siendo la más obvia la capacidad de mostrar los detalles de una distribución del tamaño de las partículas. En la medición de la distribución del tamaño de las partículas, normalmente cada distribución, ya sea que se muestre de forma acumulativa o diferencial, se compone de unos pocos cientos de puntos de datos en un intervalo de tamaño preestablecido. Cada punto de datos se denomina contenedor. Dado que se mide cada partícula, cada contenedor es un conjunto de partículas en un intervalo de tamaño determinado. Según la amplitud de la distribución, el intervalo de tamaño total se puede reajustar a una división más fina, mostrando así los detalles de la distribución (p. ej., cada contenedor se puede preajustar para cubrir un intervalo de tamaño más pequeño).

Otras ventajas incluyen un fino diferencial entre dos partículas y valores estadísticos más precisos calculados a partir de la distribución. Las siguientes cifras describen una muestra medida con el Multisizer 4 de Beckman Coulter y se visualizan en diferentes intervalos de tamaño. En la figura de la derecha, los datos de los pulsos se volcaron en un conjunto más fino de recipientes en los que se muestran más detalles de la distribución.

Procesamiento digital de pulsos

En el instrumental basado en el principio de Coulter, el cambio de resistencia eléctrica debido al paso de partículas a través de la abertura se determina utilizando circuitos electrónicos rápidos. Las señales detectadas se convierten instantáneamente en señales digitales a una velocidad de unos pocos millones de veces por segundo. Luego se registra la señal digital para cada pulso en forma de parámetros de pulso (es decir, cadencia, altura, anchura de los pulsos, etc.). Como la mayoría de las mediciones buscan obtener el recuento de partículas o la distribución de tamaños, la altura de los pulsos registrados se convierte en el tamaño de las partículas utilizando la constante de calibración y se coloca en uno de los contenedores de tamaño preestablecidos. La distribución del tamaño y el recuento de partículas son el resultado acumulativo de todos los pulsos medidos. Todos los parámetros de pulso registrados siguen estando disponibles para fines distintos de la distribución estándar del tamaño de las partículas de intervalo completo. Estos parámetros se pueden sustraer o clasificar (es decir, reprocesar de forma diferente según las aplicaciones específicas). Por ejemplo, si un operador busca tener una distribución de tamaño de acercamiento que muestre cada detalle de la distribución, entonces se puede seleccionar un intervalo de tamaño más estrecho y todos los pulsos se pueden clasificar y colocar en el nuevo conjunto de contenedores más finos. Otro ejemplo se encuentra al clasificar las alturas (o tamaños) de los pulsos en una secuencia temporal (para muestras de distribución de tamaño estrecho) para monitorizar el cambio de la muestra durante la medición. Otro ejemplo más es el uso de la altura del pulso de un gráfico en función de la anchura del pulso para encontrar información sobre la forma de las partículas.

Cuando una partícula pasa a través de la abertura, crea una resistencia. Cuanto mayor sea la partícula, mayores serán la resistencia y el voltaje. Cada pico de voltaje es directamente proporcional al tamaño de la célula. Hoy en día, todos los analizadores modernos de hematología dependen de alguna manera del principio de Coulter.

Hermanos Wallace y Joseph Coulter

Wallace and Joseph Coulter

Contador de células sanguíneas y analizador de tamaño de células automáticos de alta velocidad

High Speed Automatic Blood Cell Counter and Cell Size Analyzer

  

Diagrama del primer contador Coulter

Diagram from the first coulter counter patent application

 

Solicitud de patente original de 1953 de Coulter

Coulter's Original 1953 Patent application

 

La primera versión comercial del contador Coulter

The first commercial version of the Coulter Counter

 

Borradores de publicidad dibujados a mano del primer contador Coulter

Hand-drawn advertising drafts of the first Coulter Counter

 

Coulter Counter modelo F

Coulter Counter modelo F

Coulter Counter Model F

 

Se ideó un método para utilizar el Coulter Counter modelo F para contar los eritrocitos de cabra, que son más pequeños y más numerosos que los humanos. Se tomaron muestras de sangre de 25 cabras y se contaron las células con tubos de 100 y 70 micras de apertura. También se realizó un recuento visual de una porción de cada muestra. Los resultados fueron analizados estadísticamente para determinar qué apertura produciría los resultados más exactos y reproducibles al compararlos con los recuentos manuales. Se comprobó que los recuentos obtenidos con el tubo de apertura de 100 micras no eran significativamente diferentes de los recuentos manuales.

Esta tecnología tuvo éxito comercial en la industria médica, donde revolucionó la ciencia de la hematología. Los glóbulos rojos, los glóbulos blancos y las plaquetas constituyen la mayoría de los elementos formados en la sangre. Cuando la sangre entera humana anticoagulada se diluye con solución salina isotónica, se puede aplicar el principio de Coulter para contar y medir las diversas células que componen la sangre completa. La primera aplicación comercial del principio de Coulter en hematología se produjo en 1954 con el lanzamiento del Coulter Counter modelo A (desarrollado por Wallace y su hermano Joseph R. Coulter).

En una década, literalmente todos los laboratorios de los hospitales de los Estados Unidos tenían el Coulter Counter, y hoy en día todos los analizadores de hematología modernos dependen de alguna manera del principio de Coulter.

 

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