Réplica de protocolos publicados

En su investigación, a menudo es necesario replicar las condiciones de ejecución que observa en los protocolos publicados. Cuando revise estos protocolos asegúrese de que las instrucciones ofrezcan la información de ejecución completa, incluyendo el nombre del rotor o el radio máximo, las rpm o el RCF, y el tiempo de ejecución.

Uso de los cálculos centrífugos

Cuando revise los protocolos publicados, asegúrese de que las instrucciones ofrezcan la información de ejecución completa, incluyendo el nombre del rotor o el radio máximo, las rpm o el RCF, y el tiempo de ejecución. Por ejemplo, a menos que también se especifique un rotor o su radio máximo, no hay forma de saber qué RCF se requiere para lograr esa separación. Un rotor como elJS-5.2con un rmáx de 226 mm genera 4050 x g. Esta diferencia de 500 x g parece pequeña, pero es lo suficientemente grande como para afectar a los resultados de ciertas separaciones si no se tiene en cuenta. La preparación de los componentes sanguíneos o la etapa de sedimentación especificada por los equipos de radioinmunoensayo (RIA) son ejemplos de separaciones que requieren una atención cuidadosa de las condiciones de centrifugación.

Muchos adaptadores están diseñados para llevar una serie de pequeños tubos con fondo con un espesor de 10-15 mm o más. La mayoría de las separaciones no se verán afectadas por esta pequeña reducción del rmáx efectivo. Pero si se necesita un cálculo más exacto del RCF al utilizar dichos adaptadores, tendrá que restar el espesor del fondo del adaptador del rmax del rotor para obtener el rmax efectivo para esa combinación de adaptador de rotor.

Esto no quiere decir que una ejecución hecha en un rotor no se pueda duplicar en un rotor con un rmax diferente. Se pueden lograr los mismos resultados, pero se debe efectuar un cambio de velocidad del rotor (o del tiempo de ejecución) para compensar la diferencia de rmax. Use el nomograma que aparece a continuación para seleccionar la velocidad. Al seguir estas instrucciones, puede estimar los RCF y las velocidades de los rotores de varios radios.

También puede calcular la velocidad apropiada que se debe usar por medio de la siguiente ecuación de RCF. Digamos que desea seguir un procedimiento escrito para un rotor con un rmax de 250 mm que requiere un RCF de 3430 x g. Desea duplicar estas condiciones en el Beckman Coulter JS-5.2 que tiene un rmáx de 226 mm. En este caso, debe transponer la ecuación para resolver la velocidad en rpm, por lo que RCF = 1,12r(rpm/1000)2 se convierte en

Por lo tanto, el rotor JS-5.2 producirá un RCF de 3400 x g si se opera a unas 3681 rpm. Si las instrucciones originales hubieran especificado la velocidad y el radio del rotor que se debía utilizar, en lugar del RCF, primero tendría que haber encontrado el RCF que generó esa combinación a través de la tabla de nomograma de selección de velocidad anterior o esta ecuación:

A veces puede ser mejor cambiar el tiempo de centrifugado de las muestras que la fuerza centrífuga. Tal vez desee duplicar un procedimiento que requiere 10 minutos de centrifugación a 3000 g. ¿Puede utilizar un rotor JR-3.2 que obtiene un RCF máximo de 2300 x g? Sí, pero tendrá que procesar las muestras durante un poco más de tiempo. El tiempo necesario se puede encontrar mediante esta ecuación:

donde
t1 = tiempo de ejecución necesario para el rotor JR-3.2
t2 = tiempo de ejecución especificado en el procedimiento
RCF1 = RCF del rotor JR-3.2 a velocidad máxima
RCF2 = RCF especificado en el procedimiento

Por lo tanto, en nuestro ejemplo,

Las instrucciones dadas para los tiempos de centrifugación suelen corresponder a los tiempos que se deben establecer en el control de tiempo de la centrífuga. Este ajuste incluye el tiempo para que el rotor acelere y el tiempo a velocidad de funcionamiento, pero no el tiempo de desaceleración. Esto último depende del peso del rotor, incluyendo su carga, el tipo de sistema de freno y el ajuste del freno seleccionado por el operador. Si se utiliza un ajuste de freno máximo, un rotor completamente cargado tarda entre 1 y 3 minutos en desacelerar.

Por supuesto, la sedimentación de partículas en la muestra continúa durante la desaceleración, pero la velocidad disminuye a medida que el rotor ralentiza. Los tiempos mínimos de desaceleración se pueden obtener mediante el uso de los ajustes máximos de frenado. Sin embargo, el frenado máximo en la fase final de la desaceleración del rotor puede ser demasiado brusco cuando se utilizan botellas de gran diámetro o bolsas de sangre; el resultado puede ser una agitación y resuspensión indeseable del material sedimentado. La presencia de este material resuspendido se puede confundir fácilmente con una separación deficiente.

Una advertencia: Antes de cambiar las condiciones de centrifugación, asegúrese de que su muestra en particular no se dañe por una sedimentación más dura o por un tiempo de centrifugación más largo. Los cambios pequeños no suelen causar problemas. Sin embargo, algunas muestras biológicas se deterioran si se centrifugan demasiado tiempo, especialmente sin refrigeración. Y ciertos ensayos, que se venden en forma de kits, pueden ser sensibles al tiempo. En caso de duda, siga las instrucciones originales lo mejor posible.