Extracción de ácido nucleico vírico

Tipo de contenido: Nota de aplicación
Autor Dra. Brittany A. Niccum, Beckman Coulter Life Sciences

Introducción

La extracción de ácidos nucleicos de virus es importante tanto para la detección de patógenos como para el descubrimiento de microbios. Los genomas víricos, que pueden ser ADN o ARN, están protegidos en una cápside proteica que puede ser difícil de lisar. Para fines de investigación y clínicos, es útil tener un método de extracción de ácido nucleico que pueda lisar una gama de virus así como unir eficazmente al ADN y al ARN.

El método que se presenta aquí es un protocolo modificado que utiliza RNAdvance Blood que puede extraer ácidos nucleicos de virus de ADN y ARN. Al utilizar una tecnología basada en esferas, el método es susceptible de automatización, lo que resulta útil cuando se trata de grandes cantidades de muestras. El método se desarrolló con el aporte de un cliente. En esta nota de aplicación, informamos de la capacidad de extraer ADN de muestras que contienen VHB.

Métodos

Las muestras se lisaron añadiendo 200 μl de muestra a 10 μl de proteinasa K y 150 μl de tampón de lisis. Las muestras se pipetearon, mezclaron 10 veces y luego incubaron a temperatura ambiente durante 20 o 45 minutos. Después de la lisis, se añadió 205 μl de solución Bind 1/isopropanol, consistente en 200 μl de isopropanol y 5 μl de Bind 1. Las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 5 minutos; inmediatamente después de la incubación, las muestras se colocaron sobre un imán durante 10 minutos para tirar de las esferas. A continuación, se eliminó el sobrenadante. Las esferas se lavaron con 400 μl de tampón de lavado y se colocaron sobre un imán durante 5 minutos, y luego se eliminó el sobrenadante. Las esferas se lavaron por segunda y tercera vez con 400 μl de etanol al 70 %. Después del último lavado, las muestras permanecieron sobre el imán durante 1 minuto para dejar secar al aire. Para eluir los ácidos nucleicos víricos de las esferas, se añadió 20 μl de agua libre de nucleasa. Las muestras se incubaron durante 2 minutos a temperatura ambiente y luego se colocaron sobre un imán durante 2 minutos para eluir el ácido nucleico de interés de las esferas magnéticas. A continuación, se retiró el sobrenadante para su almacenamiento a -20 °C o -80 °C para el almacenamiento a largo plazo. Un método más detallado se presenta en el protocolo complementario de extracción de ácido nucleico vírico.

Flujo de trabajo visual

Genómica Flujo de trabajo Extracción de ácido nucleico vírico Nota de aplicación

  1. Lise la muestra en tampón de lisis y proteinasa K
  2. Una los ácidos nucleicos a las esferas magnéticas
  3. Separe las esferas de los contaminantes
  4. Lave las esferas magnéticas con tampón de lavado para eliminar los contaminantes
  5. Lave las esferas magnéticas con etanol al 70 % para eliminar los contaminantes
  6. Eluya los ácidos nucleicos de las esferas magnéticas
  7. Transfiera a la nueva placa para almacenamiento

Resultados

Para comprobar si el ARN de alto peso molecular se unió a las esferas magnéticas, se ha utilizado una escala de RNA como entrada de ácido nucleico. Se añadió marcador de ARN alto (45 ng) a 195 μl de sustituto de suero y se purificó la escala de ARN de la muestra. Las muestras se tratarom como se describe en el protocolo complementario para garantizar que las condiciones de lisis no degradasen los ácidos nucleicos. La figura 1 muestra la entrada de la muestra en el carril 1 y después los carriles de aislamiento de ARN 2-7. Los carriles 2-4 muestran recuperación después de una lisis de 45 minutos y los carriles 5-7 muestran recuperación después de una lisis de 20 minutos. Las muestras sometidas a 20 minutos de lisis tuvieron una mejor recuperación que las muestras con 45 minutos de lisis. Esto muestra que el ARN de peso molecular alto se une a las esferas magnéticas y que el tiempo óptimo de lisis es de 20 minutos.

Los siguientes experimentos y resultados fueron conducidos por Ekaterina Maiorova en el DVH, NCHHSTP,
Centros para el Control de Enfermedades en Atlanta, GA.

Se realizó un experimento similar para probar si los fragmentos de ADN vírico grandes se unirían a las esferas magnéticas.
En suero positivo para VHC y ADN vírico en agua, se añadieron fragmentos de 500 bp, 1000 bp y 2000 bp.
El ADN se purificó siguiendo el protocolo complementario. Los fragmentos después del aislamiento se visualizaron en un gel de agarosa al 2 % (figura 2). En el plasma se aislaron todos los tamaños de fragmentos y en agua solamente se aislaron los fragmentos de 500 y 1000 bp.

El ADN vírico se extrajo de seis sueros positivos en virus de la hepatitis B (VHB) utilizando 2 kits de extracción diferentes, incluyendo el que se presenta aquí. Después de la extracción, se utilizó una amplificación PCR de un paso para comprobar el ADN del VHB y se visualizó utilizando una estación de cinta Agilent 4200 (Agilent Technologies). Los productos de amplificación solo se visualizaron en las extracciones realizadas con el protocolo RNAdvance Viral Supplemental.

Conclusiones

La extracción de ácido nucleico vírico requiere condiciones lo suficientemente estrictas como para abrir la cápside vírica sin degradar el genoma del ARN o ADN. Este protocolo complementario RNAdvance Blood muestra la unión del ARN de peso molecular alto, de tamaños similares, a los genomas de ARN y los fragmentos de ADN vírico. Estos datos muestran que las condiciones de nuestro protocolo unirán los ácidos nucleicos víricos sin degradación significativa del ARN. Además, se aisló ADN de seis muestras de suero que contenían virus de la hepatitis B para verificar la lisis vírica y el rendimiento del método. Si las condiciones de lisis no cumplen con las necesidades de un cliente, se pueden optimizar mediante la prueba del equipo de principios.

Genómica Nota de aplicación Extracción de ácido nucleico vírico Figura 1
Figura 1. Una imagen del gel de agarosa de una escala de ARN en el carril 1. La escala del carril 1 fue la entrada para las otras 6 muestras. Las carriles 2-4 son la escala después de la purificación con una lisis de 45 minutos. Las carriles 5-7 son la escala después de la purificación con una lisis de 20 minutos. Hay menos degradación del ARN en las condiciones de lisis de 20 minutos, como se muestra a través del patrón de escala más distintivo en los carriles 5-7 en comparación con los carriles 2-4.

 

Genómica Nota de aplicación Extracción de ácido nucleico vírico Figura 2
Figura 2. Un gel de agarosa al 2 % donde se aislaron fragmentos de ADN de 500 bp, 1000 bp y 2000 bp de suero y agua. El carril 1 tiene una escala. Los carriles 2-4 son fragmentos de ADN purificados a partir de plasma, y los carriles 5-7 son fragmentos de ADN purificados a partir de agua. Todos los fragmentos se purificaron a partir de plasma; solo los fragmentos de 500 pb y 1000 bp se purificaron a partir de agua.

 

Genómica Nota de aplicación Extracción de ácido nucleico vírico Figura 3
Figura 3. El ADN se extrajo de suero positivo para HBV utilizando el protocolo complementario de ADN/ARN vírico de RNAdvance y otro kit. Después de la extracción, se realizó una amplificación PCR en un paso para amplificar un fragmento de 500 bp del genoma del VHB. Los carriles 2, 3 y 4 mostraron amplificación de este producto indicando un resultado positivo para la extracción de ADN del VHB utilizando el control y el protocolo complementario de ADN/ARN vírico de RNAdvance; el kit A no mostró amplificación indicando un resultado negativo.

 

Beckman Coulter no ofrece garantías de ningún tipo, expresas o implícitas, con respecto a este protocolo, incluyendo, entre otras, las garantías de idoneidad para un propósito particular o de comerciabilidad o de que el protocolo no sea infringente. Todas las garantías están expresamente rechazadas. Su uso del método es exclusivamente bajo su propio riesgo, sin recurrir a Beckman Coulter. No está destinado ni se ha validado para su uso en el diagnóstico de enfermedades u otras condiciones. Este protocolo es para demostración solamente y no está validado por Beckman Coulter. © 2019 Beckman Coulter, Inc. Todos los derechos reservados. Beckman Coulter, el logotipo estilizado y las marcas de producto y servicio de Beckman Coulter que aquí se mencionan son marcas comerciales o marcas comerciales registradas de Beckman Coulter, Inc. en los Estados Unidos y otros países. Las demás marcas comerciales son propiedad de sus respectivos propietarios.

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