Experimentos con ultracentrifugado analítico

Velocidad de sedimentación (VS)

La VS es una técnica que depende del tiempo, en la cual las partículas relevantes sedimentan a lo largo de la duración del experimento y acaban formando un precipitado en el fondo de la cubeta.

En los experimentos de VS se dispone en la cubeta de una solución inicialmente uniforme y se emplea una velocidad angular suficientemente alta como para provocar la sedimentación relativamente rápida del soluto en el fondo de la cubeta. Esto produce una reducción del soluto cerca del menisco y la formación de un límite bien definido entre la región reducida y la concentración uniforme del soluto en sedimentación. 

Aunque la velocidad de cada una de las partículas no se puede resolver, la velocidad de desplazamiento de este límite se puede medir. Esto conduce a la determinación del coeficiente de sedimentación, s, que depende directamente de la masa de las partículas e inversamente del coeficiente de rozamiento, que a su vez es una medida de la forma efectiva. Esto puede representarse mediante la ecuación:

La VS está considerada el principal método a utilizar en la mayoría de aplicaciones actuales de UCA, incluido el estudio de auto- y hetero-asociación de proteínas, el estudio de las proteínas de membrana y aplicaciones en biotecnología.¹

Equilibrio de sedimentación (ES)

Esta es una técnica de UCA independiente del tiempo, en la cual la partícula relevante alcanza un estado de equilibrio en la cubeta de la centrífuga y no precipita.

En los experimentos de ES se centrifuga un pequeño volumen de una solución inicialmente uniforme a una velocidad angular menor que la utilizada en los experimentos de VS. A medida que el soluto comienza a sedimentar hacia el fondo de la cubeta y aumenta la concentración en el fondo, el proceso de difusión se opone al proceso de sedimentación. 

Finalmente, los dos procesos opuestos alcanzan el equilibrio y la concentración del soluto aumenta exponencialmente hacia el fondo de la cubeta. En equilibrio, la distribución de soluto resultante no cambia con el tiempo. La medida de la concentración en diferentes puntos puede determinar la masa molar del soluto en sedimentación (numéricamente igual al peso molecular). Más información. 

TESTIMONIOS

“Debido al gran tamaño y a la heterogeneidad conformacional de nuestras muestras, los experimentos de velocidad de sedimentación en la ultracentrífuga analítica nos han permitido realizar muchos hallazgos cruciales sobre los mecanismos de condensación de la cromatina que no hubieran sido posibles con ninguna otra técnica”.

Dr. Jeffrey C Hansen. 
Colorado State University 

Referencias

¹ Zhao H, Brautigam CA, Ghirlando R, et al. Current Methods in Sedimentation Velocity and Sedimentation
Equilibrium Analytical Ultracentrifugation. Curr Protoc Protein Sci 2013;20:2-52.