Siete consejos para lograr el panel perfecto para la citometría de flujo multicolor

Con paneles bien diseñados y reactivos de alta calidad, la citometría de flujo multicolor es una poderosa herramienta para detectar y monitorizar de forma simultánea múltiples parámetros de su muestra.  Sin embargo, la calidad de los datos depende en gran medida de un diseño optimizado del panel y de una instrumentación adecuadamente ajustada.  Estos 7 consejos pueden ayudarle a mejorar la calidad de sus datos de citometría de flujo y a evitar los habituales inconvenientes de la citometría de flujo multicolor.

1. Selección del fluorocromo

¡No todos los colorantes se crean de la misma forma!  Algunos colorantes son extremadamente brillantes, mientras que otros son más tenues en comparación.  Sin embargo, elegir el colorante más brillante no siempre es la idea más brillante, y evitar un colorante más tenue no siempre es prudente.  En general, es aconsejable utilizar un colorante que sea lo suficientemente brillante para detectar el antígeno de interés y que al mismo tiempo cause el menor derrame o sangrado en otros detectores. El derrame ocurre cuando el espectro de emisión de un fluorocromo se detecta mediante un conjunto de detectores para medir la emisión de un fluorocromo diferente, contribuyendo así a una señal no deseada en el canal del segundo fluorocromo. Una emisión más brillante significa más potencial de derrame y más difusión de datos, lo que puede llevar a una pérdida de resolución. Para evitarlo, utilice los colorantes más brillantes para los antígenos de expresión débil y, a la inversa, utilice los colorantes más tenues para los antígenos de expresión fuerte. ¡Seguir esta regla les permitirá democratizar sus colorantes!



2. Selección de canal

Afrontémoslo, los derrames ocurren, pero aún puede optimizar su selección de colorantes para su panel. Elija fluorocromos con influencia reducida en otros canales para antígenos de expresión fuerte (columnas verdes), y asigne antígenos de expresión débil a los fluorocromos cuyo canal de detección solo se ve ligeramente afectado por los derrames de otros fluorocromos (filas amarillas). Que un fluorocromo caiga en una de las categorías anteriores dependerá de la configuración del instrumento y de la elección de los fluorocromos. Asegúrate de probar el fluorocromo y las combinaciones de canales para encontrar la mejor alineación para su panel.  

Puede ser un reto evitar el derrame cuando se diseñan experimentos que hacen uso de todos los canales disponibles, pero estos consejos pueden ayudarle a reducir el impacto que el derrame tendrá en su panel y los datos resultantes.  



3. Exclusión de los antígenos

¿Qué es un pequeño derrame entre antígenos mutuamente exclusivos?  El derrame entre los espectros de emisión de dos antígenos no interferirá con su panel si los antígenos no se expresan juntos en las mismas células en la ventana de selección celular de interés.



4. Coexpresión de los antígenos

Si un marcador tiene típica o potencialmente una densidad de expresión modulada o débil, debe tratar de reducir el derrame de las etiquetas de fluorocromo de los antígenos coexpresados en el canal de este marcador, ya que el derrame puede ocluir sus datos y enmascarar las posibles modulaciones. Solo los derrames de etiquetas de fluorocromos de antígenos no coexpresados son seguros, y no afectarán a la sensibilidad ni a la resolución de los antígenos modulados o de expresión débil. 




5. Progenitor-Descendiente

¿Responder a tus progenitores no es siempre algo malo?  En los paneles de citometría de flujo multicolor, los descendientes que responden a sus progenitores pueden preservar la sensibilidad entre los marcadores.  Traducción: puede permitir que un marcador de subconjunto o subpoblación (descendiente) se derrame sobre el marcador de ventana de selección (progenitor) o se entrecruce con el mismo.  El marcador progenitor tolerará este derrame dado que el descendiente siempre será positivo para el marcador progenitor.  Por ejemplo, si el CD4 muestra un fuerte derrame en el canal del CD3 dentro de una ventana de selección de linfocitos, el esparcimiento de fondo no causará un esparcimiento de fondo en el canal del CD3 porque los linfocitos T CD4+ también son CD3+.  Tenga cuidado con las condiciones inversas, en las que el marcador progenitor se entrecruza con el marcador descendiente, porque el derrame de la señal del progenitor contaminará el fondo de la señal del descendiente. 



6. Umbral positivo

El derrame en un antígeno coexpresado es permisible si el objetivo es solo identificar células brillantes positivas, o discriminar entre la expresión brillante y semifuerte/atenuada. Sin embargo, no se puede tolerar el derrame cuando el objetivo sea solo discriminar entre expresión tenue y negativa, ya que esto enturbiará sus datos y conclusiones, dando lugar a falsos positivos. 



7. Complejidad del derrame

Despídase de la complejidad y trate de mantener los patrones de derrame tan simples y directos como sea posible para evitar los límites de detección dependientes del fenotipo.  Recuerde, sin embargo, que habrá derrame y propagación de fluorocromos que no se muestran en su gráfico de puntos, por lo que "mantenerlo simple" podría ser bastante complicado.
 




Tenga presente estos 7 consejos al planificar su próximo ensayo de citometría de flujo multicolor, y su panel le recompensará con una detección de señal óptima y una mayor certeza de los resultados con una complejidad reducida. Para mejorar aún más sus probabilidades de éxito con la citometría de flujo multicolor, utilice reactivos robustos y de alta calidad que hayan sido sometidos al escrutinio de las agencias reguladoras y los estándares de fabricación. 

Cuanto más fiables sean sus reactivos, más fiables serán sus datos.
 

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