Sistema CellMek SPS: Preparación de muestras
Poblaciones detectadas en porcentaje a partir de preparaciones de muestras automatizadas frente a preparaciones manuales empleando un proceso de trabajo de lavado/tinción/lisado y fijación/lavado con un panel de anticuerpos de 10 colores en formato líquido o seco.
Kelly Andrews, Gang Xu, Xizi Dai, Karen Lo, Jessica Ashbaugh, Jin Zhang, Ernesto StaroswieckiInvestigación y Desarrollo, Beckman Coulter Life Sciences, Miami, FL, Estados Unidos
Proceso de trabajo
Preparación de muestras
Sistema de preparación de muestras
Cóctel de reactivos secos de 10 colores
Adquisición de muestras
Introducción
El Instrumento CellMek SPS es un sistema automatizado de preparación de muestras para uso diagnóstico in vitro en laboratorios de citometría de flujo, diseñado para procesar sangre total, médula ósea y otros especímenes unicelulares relevantes para el análisis posterior de la citometría de flujo.Los procesos de trabajo clínicos consisten generalmente en el lavado de un volumen determinado de espécimen, la tinción con anticuerpos líquidos o secos, el lisado de glóbulos rojos y la fijación de los glóbulos blancos (WBC) teñidos, el lavado de la muestra preparada lisada/fijada y la reconstitución en solución tampón para el posterior análisis de la citometría de flujo. Se ha elegido un proceso como este, en el que se utilizan todos los módulos del instrumento CellMek SPS, para valorar este sistema en comparación con las muestras preparadas manualmente. Los módulos empleados incluyen el módulo de transporte de muestras, el módulo de la placa de reacción, el módulo de lavado de células, el módulo de reactivos secos, el módulo de anticuerpos líquidos, el módulo de reactivos de preparación y el módulo de salida.
Métodos
La sangre entera, la médula ósea y otras suspensiones unicelulares (líquido cefalorraquídeo y otros fluidos corporales) se obtienen de donantes normales y clínicos (97 donantes únicos) y se procesan con un proceso de trabajo de lavado/tinción/lisado y fijación/lavado con un panel de anticuerpos de 10 colores personalizado en el formato DURACartridge seco o en el formato de cóctel líquido. El panel de 10 colores incluye Kappa-FITC, Lambda-PE, CD10-ECD, CD5-PC5.5, CD200-PC7, CD34-APC, CD38-AA700, CD20-AA750, CD19-PB y CD45-KrO.
Tabla 1. Panel de anticuerpos de 10 colores personalizado en formato de reactivos líquidos o DURACartridge secos.
Panel de anticuerpos | Combinación de marcadores y fluorocromos (formato líquido o DURACartridge) | |||||||||
FITC | PE | ECD | PC5.5 | PC7 | APC | AA700 | AA750 | PB | KrO | |
Panel de 10 colores |
Kappa | Lambda | CD10 | CD5 | CD200 | CD34 | CD38 | CD20 | CD19 | CD45 |
Las muestras se preparan por duplicado en uno de los tres instrumentos CellMek SPS y se analizan un total de 152 datos para leucocitos CD45+ WBC y subpoblaciones detectadas (en mezcla líquida y seca). Cada muestra procesada con el instrumento CellMek SPS se compara con la misma muestra del donante correspondiente preparada manualmente con un proceso de trabajo y usando reactivos equivalentes. Todas las muestras preparadas se adquieren en un citómetro de flujo Navios y se analizan mediante el software Kaluza C. La comparación del procedimiento de medición y la evaluación del sesgo están realizados por expertos en bioestadística.
Los resultados esperados para el sesgo total a partir de la referencia del porcentaje positivo:
- diferencia de puntos ± 5% para subpoblaciones positivas % ≤ 20%
- diferencia de puntos ± 8% para subpoblaciones positivas % > 20%
Table 2. Sesgo total frente a la referencia preparada manualmente de subpoblaciones delimitadas con porcentaje positivo en los percentiles.
Analyte | Percentile | Level | Bias | 95% Confidence Limits | Acceptance Limit (±) |
Conclusion | |
Lower | Upper | ||||||
Lymphocytes | 25 | 19.175 | -0.702 | -1.051 | -0.353 | 5 | Pass |
50 | 30.075 | -0.865 | -1.255 | -0.475 | 8 | Pass | |
75 | 41.055 | -1.028 | -1.589 | -0.468 | 8 | Pass | |
Monocytes | 25 | 5.075 | 0.757 | 0.569 | 0.944 | 5 | Pass |
50 | 6.805 | 0.723 | 0.527 | 0.920 | 5 | Pass | |
75 | 8.825 | 0.684 | 0.468 | 0.900 | 5 | Pass | |
Granulocytes | 25 | 49.005 | -0.251 | -0.718 | 0.217 | 8 | Pass |
50 | 59.945 | -0.219 | -0.615 | 0.177 | 8 | Pass | |
75 | 71.040 | -0.187 | -0.579 | 0.205 | 8 | Pass | |
CD38+ | 25 | 5.200 | 0.826 | 0.639 | 1.014 | 5 | Pass |
50 | 6.448 | 0.786 | 0.595 | 0.977 | 5 | Pass | |
75 | 8.695 | 0.714 | 0.501 | 0.926 | 5 | Pass | |
CD10+ | 25 | 33.890 | 0.602 | 0.178 | 1.026 | 8 | Pass |
50 | 54.775 | 0.417 | 0.084 | 0.751 | 8 | Pass | |
75 | 63.570 | 0.340 | -0.003 | 0.682 | 8 | Pass | |
CD34+ | 25 | 0.025 | -0.025 | -0.106 | 0.056 | 5 | Pass |
50 | 0.050 | -0.025 | -0.106 | 0.056 | 5 | Pass | |
75 | 0.170 | -0.025 | -0.106 | 0.055 | 5 | Pass | |
CD5+CD19- (Lymphocytes) |
25 | 66.650 | -1.062 | -1.508 | -0.616 | 8 | Pass |
50 | 73.255 | -0.832 | -1.105 | -0.559 | 8 | Pass | |
75 | 78.620 | -0.645 | -0.990 | -0.300 | 8 | Pass | |
CD200+CD19- (Lymphocytes) |
25 | 4.123 | 0.603 | 0.382 | 0.825 | 5 | Pass |
50 | 8.303 | 1.023 | 0.818 | 1.227 | 5 | Pass | |
75 | 13.410 | 1.535 | 1.092 | 1.978 | 5 | Pass | |
CD19+CD20+ (Lymphocytes) |
25 | 6.423 | 0.300 | 0.110 | 0.489 | 5 | Pass |
50 | 11.100 | 0.619 | 0.391 | 0.847 | 5 | Pass | |
75 | 16.728 | 1.004 | 0.626 | 1.381 | 5 | Pass | |
Kappa+ (CD19+CD20+) |
25 | 56.025 | 0.933 | -0.893 | 2.758 | 8 | Pass |
50 | 58.850 | 0.555 | -0.555 | 1.665 | 8 | Pass | |
75 | 62.160 | 0.112 | -0.357 | 0.581 | 8 | Pass | |
Lambda+ (CD19+CD20+) |
25 | 36.630 | -0.027 | -0.442 | 0.388 | 8 | Pass |
50 | 40.030 | 0.052 | -0.286 | 0.390 | 8 | Pass | |
75 | 43.120 | 0.124 | -0.248 | 0.496 | 8 | Pass |
Table 3. Sesgo del subcomponente frente a la referencia preparada manualmente de subpoblaciones delimitadas con porcentaje positivo en los percentiles.
Sub- component |
Group | Percentile | Level | Bias | 95% Confidence Limits | Acceptance Limit (±) |
Conclusion | |
Lower | Upper | |||||||
Sample Preparation Panel Design |
Typical Incubation |
25 | 5.895 | 0.493 | 0.380 | 0.606 | 5 | Pass |
50 | 20.263 | 0.349 | 0.216 | 0.483 | 8 | Pass | ||
75 | 56.340 | -0.012 | -0.294 | 0.269 | 8 | Pass | ||
Throughput Optimized |
25 | 6.605 | 0.493 | 0.300 | 0.687 | 5 | Pass | |
50 | 25.505 | 0.176 | -0.030 | 0.381 | 8 | Pass | ||
75 | 58.765 | -0.384 | -0.713 | -0.054 | 8 | Pass | ||
Instrument | 1 | 25 | 5.740 | 0.593 | 0.471 | 0.714 | 5 | Pass |
50 | 20.740 | 0.323 | 0.201 | 0.446 | 8 | Pass | ||
75 | 57.820 | -0.342 | -0.550 | -0.135 | 8 | Pass | ||
2 | 25 | 7.280 | 0.259 | 0.062 | 0.456 | 5 | Pass | |
50 | 27.240 | 0.322 | -0.062 | 0.707 | 8 | Pass | ||
75 | 54.820 | 0.410 | -0.345 | 1.164 | 8 | Pass | ||
3 | 25 | 7.445 | 0.280 | -0.011 | 0.571 | 5 | Pass | |
50 | 18.920 | 0.233 | -0.022 | 0.488 | 5 | Pass | ||
75 | 58.370 | 0.072 | -0.346 | 0.491 | 8 | Pass | ||
Antibody Format |
Dry | 25 | 6.238 | 0.387 | 0.272 | 0.502 | 5 | Pass |
50 | 21.193 | 0.228 | 0.083 | 0.373 | 8 | Pass | ||
75 | 57.135 | -0.154 | -0.459 | 0.151 | 8 | Pass | ||
Liquid | 25 | 5.850 | 0.703 | 0.519 | 0.886 | 5 | Pass | |
50 | 22.480 | 0.444 | 0.277 | 0.610 | 8 | Pass | ||
75 | 58.295 | -0.113 | -0.366 | 0.140 | 8 | Pass | ||
Anti- coagulant |
ACD | 25 | 6.230 | 0.491 | 0.377 | 0.606 | 5 | Pass |
50 | 22.710 | 0.317 | 0.204 | 0.429 | 8 | Pass | ||
75 | 57.475 | -0.052 | -0.246 | 0.142 | 8 | Pass | ||
EDTA | 25 | 7.565 | 0.523 | 0.416 | 0.631 | 5 | Pass | |
50 | 25.138 | 0.250 | 0.154 | 0.345 | 8 | Pass | ||
75 | 58.345 | -0.268 | -0.427 | -0.109 | 8 | Pass | ||
Heparin | 25 | 6.855 | 0.130 | -0.045 | 0.304 | 5 | Pass | |
50 | 33.395 | 0.186 | -0.002 | 0.374 | 8 | Pass | ||
75 | 56.605 | 0.236 | -0.060 | 0.531 | 8 | Pass | ||
None | 25 | 2.460 | 0.783 | 0.292 | 1.275 | 5 | Pass | |
50 | 12.208 | 0.537 | -0.056 | 1.130 | 5 | Pass | ||
75 | 50.065 | -0.419 | -1.758 | 0.919 | 8 | Pass | ||
Specimen Type | BM | 25 | 5.255 | 0.682 | 0.516 | 0.849 | 5 | Pass |
50 | 20.280 | 0.423 | 0.255 | 0.592 | 8 | Pass | ||
75 | 55.660 | -0.187 | -0.498 | 0.124 | 8 | Pass | ||
Body Fluid | 25 | 2.213 | 0.933 | 0.390 | 1.476 | 5 | Pass | |
50 | 10.648 | 0.699 | 0.040 | 1.357 | 5 | Pass | ||
75 | 48.283 | -0.347 | -1.932 | 1.237 | 8 | Pass | ||
CSF | 25 | 4.140 | 0.010 | -1.006 | 1.026 | 5 | Pass | |
50 | 14.973 | -0.130 | -1.038 | 0.778 | 5 | Pass | ||
75 | 67.520 | -0.812 | -2.701 | 1.077 | 8 | Pass | ||
WB | 25 | 7.390 | 0.347 | 0.266 | 0.428 | 5 | Pass | |
50 | 28.270 | 0.195 | 0.118 | 0.272 | 8 | Pass | ||
75 | 58.055 | -0.022 | -0.145 | 0.102 | 8 | Pass |
Conclusión
Existe un resultado equivalente en la preparación de muestras entre el proceso automatizado del CellMek SPS y el de preparación manual, independientemente de las fuentes comunes de variabilidad. El sesgo total de la referencia preparada manualmente de las subpoblaciones con porcentaje positivo es de 5 puntos porcentuales para las poblaciones ≤ 20% y de 8 puntos porcentuales para las poblaciones > 20%. El análisis de las subpoblaciones del diseño del panel de preparación de muestras (incubación típica o producción optimizada), del instrumento (1, 2 o 3), del formato de anticuerpos (líquidos o secos), del anticoagulante (EDTA, ACD, heparina o ninguno) y del tipo de muestra (sangre entera, médula ósea, fluido corporal o líquido cefalorraquídeo) se valora en un conjunto de datos con marcadores agrupados. Todas las categorías de subcomponentes analizadas presentan no más de 5 puntos porcentuales para las poblaciones ≤ 20% y no más de 8 puntos porcentuales para las poblaciones > 20%.