Introducción

Conforme la citometría de flujo continúa desarrollando capacidades cada vez mayores, la adición de láseres, más detectores y mejor procesamiento de señales, las aplicaciones de elevados parámetros han comenzado a salir de los laboratorios especializados y a introducirse en la práctica corriente. Los usuarios suelen encontrar el proceso de establecer estas aplicaciones de elevados parámetros intimidante: lograr datos de alta calidad requiere varias iteraciones de combinaciones de anticuerpos-fluorocromo para conformar un panel y pruebas exhaustivas para garantizar resultados sólidos. Las innovaciones en la detección de señales de citometría de flujo facilitan el proceso de diseño de paneles y generación de datos.

La utilización de fotodiodos de avalancha (APD, por sus siglas en inglés) para la detección de señales en el CytoFLEX ofrece dos ventajas clave a la hora de facilitar el diseño de paneles. En primer lugar, los APD son más sensibles que los tubos fotomultiplicadores (PMT) en un tramo más amplio del espectro. En segundo lugar, esta mayor fotosensibilidad produce un menor error de medición, lo que minimiza la dispersión. (1) La minimización de la dispersión de spillover (valores sobrantes) en experimentos de un número elevado de parámetros permite una mejor discriminación entre poblaciones tenues y negativas, lo que resulta en una selección de canales menos crítica para los marcadores tenues. Dando un paso más, se puede lograr una mayor facilidad de diseño mediante el uso de paneles de reactivos secos y unificados como DURAClone. El uso de paneles IM de DURAClone como columna vertebral permite al investigador dejar manchas adicionales según sea necesario, manteniendo a la vez muchos parámetros estables y preoptimizados.

La combinación de las innovadoras tecnologías de CytoFLEX y DURAClone permite la creación de experimentos de elevados parámetros con menos esfuerzo en el diseño y la configuración. En este sentido, demostraremos la facilidad de diseño de paneles y la generación de datos fiables, utilizando el panel de subconjunto de linfocitos T DURAClone IM yCytoFLEX LX. Además, con el elevado número de canales de detección en el CytoFLEX LX, se puede modificar una única columna vertebral de DURAClone IM para adaptarla a múltiples diseños y necesidades experimentales, lo que permite respuestas rápidas a nuevas preguntas en el laboratorio. Este documento se centra en un panel de 18 colores diseñado y probado rápidamente mediante estas tecnologías.

Figura 1. Comparación entre sistemas basados en PMT y basados en APD.

Panel A. Gráfico que representa la eficiencia cuántica (QE), es decir, el rendimiento de conversión de fotones-electrones, de los APD y los PMT en el intervalo espectral. Este rendimiento de conversión de fotones-electrones más elevado reduce el error de medición, lo que facilita una mayor sensibilidad y resolución. Gráfico adaptado de “A Comparison of Avalanche Photodiode and Photomultiplier Tube Detectors for Flow Cytometry” por Paul Wallace et al, 2008, Proceedings of SPI, Vol 6859. ²

Panel B. La comparación de microesferas de 8 picos Spherotech en PMT (izquierda) y APD (derecha) muestra una mejor resolución de las microesferas más tenues debido a un aumento de QE, especialmente en las longitudes de onda de emisión superiores a 650 nm.

Panel C. Un QE más elevado también contribuye a la reducción de la dispersión de datos en los detectores adyacentes en sistemas basados en APD (derecha) en comparación con los sistemas basados en PMT (izquierda).

Panel D. Comparación del flujo de trabajo de diseño de paneles de anticuerpos con y sin usar DURAClone. Los paneles DURAClone hacen que la construcción de paneles grandes sea menos laboriosa, ya que proporcionan reactivos estables preoptimizados para la columna vertebral del panel. Utilice DURAClone solo o pruebe y añada más colores.

Materiales y métodos

CONSEJOS PARA TENER ÉXITO

• Cuando se utilizan varios colorantes violeta brillante o ultravioleta brillante, se debe añadir un tampón de tinción brillante al tubo DURAClone antes de añadir estos colorantes para evitar interacciones de colorante que puedan provocar artefactos.
• Agite el tubo DURAClone inmediatamente después de añadir la muestra y los conjugados de anticuerpos adicionales para garantizar una mezcla adecuada de los reactivos.

Resultados

Figura 5. Diseño de paneles de 17 marcadores y 18 colores. El panel anterior muestra las combinaciones de marcadores-fluorocromos utilizadas en este estudio. La columna vertebral del subconjunto de linfocitos T DURAClone IM, que consta de 10 colores, viene marcada en rojo. Los canales que no se han utilizado están sombreados en gris.

Figura 6a. Estrategia de selección de alta pureza.

Linfocitos T CD4+

Figura 6b.Análisis de subconjunto de linfocitos T CD4

Linfocitos T CD8+

Figura 6c. Análisis de subconjunto de linfocitos T CD8

Linfocitos B

Figura 6d. Análisis de subconjunto de linfocitos B

Figura 7. Matriz de compensación y selección jerárquica

Durante este experimento se analizó un total de tres donantes sanos, 24 horas después de la venopunción. Comenzando con el subconjunto de linfocitos T IM DURAClone, que comprende 10 colores, como columna vertebral, se añadieron ocho marcadores para completar el panel. Las combinaciones de marcador-fluorocromo cumplen los principios estándar del diseño multicolor y también tienen en cuenta la disponibilidad de conjugados para los marcadores deseados.

Antes de profundizar en el análisis de los linfocitos T, se aplica una estrategia de selección preliminar. Se excluyen las células muertas utilizando el colorante de viabilidad ajustable IR y las células vivas seleccionadas. A continuación, las células vivas se trazan gráficamente como SSC frente a CD45, que se utiliza para identificar los glóbulos blancos (WBC); se dibuja una ventana de selección alrededor de los leucocitos para excluir los residuos. La ventana de selección de linfocitos se dibuja alrededor de la población con un perfil de fluorescencia de CD45 alto y un SSC bajo. Los linfocitos se diferencian todavía más mediante la selección de duplicados y la eliminación de los monocitos (CD33⁺) del análisis. Por último, añadimos la representación del tiempo como verificación interna de la fluidez y estabilidad del sistema durante las ejecuciones experimentales (Figura 6a).

Se evaluó aquí un total de 24 poblaciones, aunque no se está limitado a estas, en los subconjuntos de linfocitos T. Para iniciar este análisis, empezamos por una región de células en CD3⁺ que caen en la región de los linfocitos. Esto nos permite separar los linfocitos T CD4⁺ y CD8⁺ de otros tipos de células que podrían expresar estos marcadores, como los linfocitos NK (CD8) o los monocitos (CD4).

Al echar un vistazo más a fondo a los subconjuntos T CD4, los linfocitos T reguladores están formados por una población de linfocitos T CD4⁺CD25⁺. Dado que este marcador suele ser bastante tenue y, por tanto, resulta más difícil de abrir con confianza en paneles multicolor con gran potencial de dispersión de datos, hemos incluido un control de fluorescencia menos uno (FMO) para aumentar la confianza. Seleccionando en las células CD4⁺, también podemos evaluar la expresión de CCR4 como función de Tregs: mientras el marcador CCR4 desempeña un papel fundamental en el ajuste de posición en las células de la piel, un subconjunto de CCR4⁺ se ha indicado que controla la supresión de los linfocitos T reguladores efectores.³

Combinando CD45RA con CCR7, podemos empezar a examinar las diferentes etapas o subgrupos de linfocitos T durante la activación; es decir, sin tratamiento previo (CD45RA+CCR7+), central (CD45RA-CCR7+), memoria, efector (CD45RA+CCR7-) y células de memoria efectoras (CD45RA-CCR7-). Cada fenotipo puede evaluarse con mayor profundidad observando las diversas expresiones de las moléculas coestimuladoras CD27 y CD28.

El programa de muerte celular 1 (PD-1) es un miembro de la superfamilia CD28 y es responsable de mejorar los linfocitos T reguladores, a la vez que impide la función de los linfocitos T efectores. Por último, CD95 es responsable de la apoptosis celular. CD95 se expresa principalmente en los linfocitos T de memoria, pero una pequeña porción de los linfocitos T con fenotipo sin tratamiento previo también expresa CD95 y se consideran linfocitos T “tipo célula madre”, de tipo memoria (Figura 6b).⁴

Echemos un vistazo a los subconjuntos de linfocitos T CD8, con un enfoque similar al que utilizamos para analizar los subconjuntos de marcadores CD45RA, CCR7, CD28 y CD27 como hicimos en CD4. El subconjunto CD8⁺CD57⁺ denota linfocitos T terminalmente diferenciados con una capacidad citotóxica elevada pero baja capacidad proliferativa. La expresión de CD95 como función en CD45RA se evalúa nuevamente en este subconjunto de linfocitos T. (Figura 6c)

Aunque no se ven tintados tan bien en este panel como los linfocitos T, también se pueden ver los linfocitos B (CD19⁺, CD20⁺, HLA-DR⁺) que se seleccionan en la población de CD3^- . Si se desea obtener más detalles sobre esta población u otros tipos de células, los canales abiertos en el panel de columna vertebral deberían permitir la realización de cambios fácilmente. (Figura 6d)

Conclusiones

En esta nota de aplicación ilustramos la facilidad de uso de los ensayos de reactivos unificados secos DURAClone como columna vertebral para paneles de inmunofenotipado más profundos. Empezar con una columna vertebral y con canales abiertos en un citómetro permite obtener resultados rápidos y aporta la seguridad de saber que varios de los parámetros del panel están preoptimizados. Este método también permite aumentar la flexibilidad en el laboratorio, ya que se pueden configurar reactivos “drop-in” para hacer preguntas específicas de investigación.

Es más, el uso de tubos de DURAClone IM reduce el tiempo de administración de los reactivos y disminuye la posibilidad de error al pipetear varios reactivos en múltiples tubos de muestras.

Por último, la sensibilidad de los detectores APD en CytoFLEX permite un diseño flexible en paneles de elevados parámetros. Los marcadores expresados de forma tenue ya no requieren la colocación de dicho marcador en los canales de alto rendimiento, como sucede con la colocación de CD25 BV786 en el canal V763. Aunque se realizó una FMO, la separación entre CD4⁺CD25^- y CD4⁺CD25⁺ quedó claramente visible, lo que destacó la capacidad del sistema para distinguir poblaciones atenuadas frente a negativas.

Protocolo

1. Controles de compensación de tinción de DURAClone (incluidos con el kit DURAClone)
   1. Coloque un tubo de control de compensación de cada en una gradilla
   2. Añada una gota de cada de esferas positivas y negativas de VersaComp a cada tubo
   3. Incube de 20 minutos a temperatura ambiente y proteja de la luz
   4. Añada 1 ml de PBS+1% BSA a cada tubo y centrifugue a 300x g durante 6 minutos
   5. Decante el sobrenadante
   6. Vortex
   7. Resuspenda en 400 µl de tampón PBS+1 % BSA
2. Cree controles de compensación de reactivos “drop-in”
   1. Añada una gota de cada de esferas positivas y negativas de VersaComp al tubo
   2. Incube de 20 minutos a temperatura ambiente y proteja de la luz
   3. Añada 1 ml de tampón PBS+1% BSA a cada tubo y centrifugue a 300 x g durante 6 minutos
   4. Decante el sobrenadante
   5. Vortex
   6. Resuspenda en 400 µl de tampón PBS+1 % BSA
3. Prepare la sangre teñida
   1. Añada 50 μl de tampón de tinción brillante a cada tubo DURAClone
   2. Añada cantidades de prueba ajustadas de cada anticuerpo drop-in e iFluor 860 a cada tubo DURAClone
   3. Etiquete un tubo adicional de 12 x 75 mm como sangre completa sin teñir

ADQUISICIÓN

4. Puesta en marcha diaria

 a. Ejecute el programa de inicio del sistema CytoFLEX
b. Verifique la configuración del detector

Figura 2. Configuración del detector de un CytoFLEX LX equipado con el láser UV.

c. Ejecute el procedimiento de control de calidad de acuerdo con el manual del usuario: “Instrucciones de uso de la serie CytoFLEX”, número de documento B49006xx

5. Cree un experimento de compensación
a.Para los controles y drop-ins de DURAClone, incluya el número de lote que permita actualizar los controles de compensación cuando se cambie de lotes
b. Seleccione Bead (esfera) en la columna Sample Type (Tipo de muestra) para reflejar los controles de color único

Figura 3. Ventana de configuración de compensación, donde el operario puede seleccionar los canales y el tipo de muestra.

c. Desmarque utilizando un negativo universal, ya que las esferas VersaComp tienen un pico negativo en cada tubo

Figura 4. Ejemplo de ejecución y selección de un solo color.

d. Registre cada muestra de compensación
i.Mueva la compuerta de dispersión para que contenga esferas individuales
ii. Utilice la barra deslizante log-lineal para ajustar la población negativa y mover la ventana de selección para que contenga la población negativa
iii. Mueva la ventana de selección para que contenga la población positiva
e. Calcule la matriz de compensación y guárdela en la biblioteca

 6. Cree un experimento en CytExpert
a. Importe la biblioteca de compensación creada y convierta la matriz en función de las ganancias actuales
b. Cree los gráficos
c. Registro

Referencias

1. Nguyen R, Perfetto S, Mahnke YD, et al. Quantifying spillover spreading for comparing instrument performance and aiding in multicolor panel design. Cytometry A 2013 Mar; 83 (3): 306-315. Disponible en la URL: 2013 Feb 6; doi: 10.1002/cyto.a.22251.
2. Lawrence W, Varadi G, Entine G, et al. A Comparison of Avalanche Photodiode and Photomultiplier Tube Detectors for Flow Cytometry. Proceedings of SPIE 2008 Feb; Vol 6859. Disponible en la URL: 2008 Feb; doi: 10.1117/12.758958.
3. Baatar D, Olkhanud P, Sumitomo K, et al. Human Peripheral Blood T Regulatory Cells (Tregs), Functionally Primed CCR4+ Tregs and Unprimed CCR4− Tregs, Regulate Effector T Cells Using FasL. J Immunol 2007 Apr 15; 178(8): 4891–4900.
4. Gattinoni L, Lugli E, Ji Y, et al. A human memory T-cell subset with stem cell-like properties. Nat Med 2011 Sep 18; 17(10): 1290–1297. Disponible en URL: doi:10.1038/nm.2446.
5. Van de Veen W, Stanic B, Yaman G, et al. IgG4 production is confined to human IL-10–producing regulatory B cells that suppress antigen-specific immune responses. J ALLERGY CLIN IMMUNOL 2013 APR; 131 (4).
6. Mauri C, Menon, M. The expanding family of regulatory B cells. International Immunology 2015 JUN; 27 (10): 479-486.

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