Simplificación del aislamiento de exosomas

Se ha descrito el Modelo molecularultracentrifugado diferencial como el método de referencia para el aislamiento de exosomas,1 debido a su amplia utilización y a la alta pureza de las fracciones exosomales que produce. Automatizar los flujos de trabajo secuenciales de aislamiento y caracterización puede mejorar la velocidad y la precisión, al mismo tiempo que reduce el tiempo dedicado y la variabilidad entre muestras. A pesar de ser un planteamiento aparentemente sencillo -múltiples rotaciones a múltiples velocidades- hay varios pasos en el flujo de trabajo que pueden ser difíciles de estandarizar con procedimientos manuales. Para mejorar el valor de su aislado de exosomas y de los datos que se puedan derivar, la automatización de la manipulación de líquidos garantiza la reproducibilidad, trazabilidad y precisión. Sepa cómo la automatización puede permitir análisis más profundos, mayor flexibilidad en las aplicaciones posteriores y una identificación más precisa de los pequeños cambios en los cargamentos exosomales en el tiempo y según las condiciones.  

Cultivo de células hasta la fase exponencial

Nota: Si su material de partida es un biofluído procedente de una biopsia líquida, puede saltarse esta sugerencia.

En la mayoría de los laboratorios cultivar células hasta la fase exponencial es algo trivial. Lo único que se necesita es un poco más de tiempo y un hemocitómetro, así que no es el crecimiento de células hasta la fase exponencial lo que requiere más atención, es la siembra de células antes del crecimiento. A menudo, a pesar de los esfuerzos de los científicos, el recuento obtenido por el hemocitómetro puede estar sesgado por varias variables, como la agregación, la no homogeneidad de la mezcla y un cálculo inadecuado. Para que los errores en la densidad celular no estropeen el aislamiento de exosomas desde el primer momento, los contadores celulares fiables   y la automatización de la manipulación de líquidos para siembra de células pueden aportar la precisión y estandarización que a veces se echan de menos en el trabajo cotidiano de manipulación en el laboratorio. 

Las siembras celulares insuficientes o excesivas requieren una vigilancia de control por espectrofotómetro para no perder la fase de crecimiento exponencial y las placas sembradas simultáneamente con células mal contadas pueden no estar listas para la recolección simultánea de exosomas. Las células sembradas con una densidad predecible deberían alcanzar la fase exponencial en un tiempo predecible, de esta forma se mantendrá el análisis dentro de los plazos. Cuando se trabaja con células adherentes de mamíferos, normalmente se mantienen varios cultivos simultáneos, lo que permite la evaluación de la fase de crecimiento por espectrofotómetro sin alteración de las células experimentales. Más allá de las ventajas obvias de estandarizar su método de siembra celular, conocer los atributos típicos de crecimiento de sus líneas celulares le advertirá de posibles problemas con sus células o condiciones de cultivo. Si sus células normalmente alcanzan confluencia en 18 horas, pero se retrasan o se adelantan, puede que sea el momento de caracterizar una nueva alícuota celular o puede indicar un cambio en los componentes del medio o de las condiciones de incubación.

¿Por qué es importante la fase de crecimiento exponencial cuando se recolectan exosomas?

Dado que los exosomas son el criterio de valoración deseado, las condiciones en las que se cultivan las células –bajo las cuales se liberan los exosomas– pueden influir directamente en la calidad de los exosomas y en el valor de su cargamento. Por ejemplo, las células cultivadas en condiciones de estrés –similares a las que se encuentran en cultivos superpoblados en fase estacionaria– mostraron un cambio en sus cargamentos exosomales que reflejaba la mayor severidad de las condiciones ambientales.2 Si el objetivo experimental es recolectar cargamentos exosomales en condiciones normales, es importante garantizar que los exosomas se recolectan en el momento oportuno.

Conozca el rotor para un ultracentrifugado preciso

Acercarse a la ultracentrífuga compartida puede resultar intimidante. Es un aparato costoso y todos hemos oído historias de terror sobre personas que usaron tubos erróneos o una conversión RPM/rcf/g equivocada provocando daños en la máquina, sin mencionar la pérdida de sus valiosas muestras. El ultracentrifugado demanda un alto nivel de precisión, no solo al preparar las muestras, sino cuando se selecciona el rotor adecuado a la tarea. La elección de un rotor con un bajo factor k, que se refiere a un cálculo basado en la velocidad angular de la centrífuga y los radios del rotor, garantiza el centrifugado diferencial más eficaz de sus muestras.1 Por ejemplo, un rotor oscilante muestra una mayor diferencia entre los radios máximo y mínimo que un rotor de ángulo fijo, lo que significa que muestras idénticas en un rotor de ángulo fijo se deben clarificar más rápido y con una separación más precisa de biopartículas dentro del gradiente de densidad según su punto isopícnico, que en un rotor oscilante. Tenga presente que el factor k se refiere a un rotor concreto cuando se usa en una centrífuga concreta y se debe recalcular para cada combinación rotor/centrífuga. La velocidad es otra variable que debe tenerse en cuenta. Variará según el rotor que se utilice y los ajustes seleccionados. Es esencial asegurarse de que sus muestras están girando a la velocidad correcta durante el tiempo adecuado para que el aislamiento de exosomas con ultracentrifugado diferencial funcione bien. Para reducir al mínimo la posibilidad de que un rotor inadecuado impida que sus muestras precipiten adecuadamente, confíe la selección de su rotor a la Herramienta de selección de rotores Beckman.

Preparación del gradiente de densidad

Ultracentrífuga de gradiente de densidad

Los gradientes de densidad son esenciales para la purificación de exosomas aislados, ya que aprovechan la diferencia de densidad entre los exosomas y otras partículas de tamaño similar, como virus y pequeños cuerpos apoptóticos, para separarlos de forma fiable. La forma clásica de elaborar gradientes de densidad es a través de soluciones cada vez más concentradas de sacarosa, pero nuevos protocolos preconizan el uso de un gradiente de iodixanol para una mejor separación y preservación isoosmótica del tamaño de los exosomas. Frecuentemente se proponen otros métodos de aislamiento de exosomas, pero ninguno ha demostrado superar el ultracentrifugado con gradiente de densidad en cuanto a la pureza de exosomas y diversidad de cargamentos.3 Dado que el gradiente de densidad es fundamental para la pureza de los exosomas preparados en ultracentrífuga, es vital asegurar la correcta preparación de las soluciones constituyentes, así como la estratificación precisa del gradiente. Para este propósito, la manipulación automática de líquidos es una opción lógica. Un manipulador automático de líquidos es capaz de estratificar con precisión las soluciones de iodixanol/sacarosa para formar un gradiente de densidad discontinuo.

Determinación del tamaño y la concentración de exosomas

Una vez aislados, los exosomas se pueden analizar directamente para conocer su cargamento (proteínas, lípidos, ácidos nucleicos, etc.) o se pueden caracterizar más para intentar averiguar sus células de origen. Un paso habitual de la caracterización que se puede automatizar es el análisis de tamaño de los exosomas, que se basa en el seguimiento de nanopartículas para identificar tanto la distribución de tamaño de los exosomas, como su concentración en el solvente. Se puede incorporar fácilmente un dispositivo de análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) al proceso de aislamiento y caracterización completos de los exosomas, lo que permite la determinación precisa y reproducible del tamaño y la concentración de exosomas.

Facilitar el análisis posterior

En la mayoría de los casos el objetivo final del aislamiento de exosomas no es simplemente recolectar exosomas, sino conocer su cargamento como forma de comprender esta forma de comunicación intercelular recién descubierta. Los científicos han logrado aislar ADN,4 ARN,5,6 y proteínas7,8 a partir de los exosomas y los han utilizado para analizar los componentes clave y los impactos de estos pequeños mensajeros. Algunos de estos análisis, como la secuenciación de ARN, requieren reacciones cuidadosamente acopladas de forma reproducible, lo cual se puede conseguir con la manipulación automática de líquidos, mientras que otros, como el enzimoinmunoanálisis de adsorción, requieren preparación de placas, incubación y capacidad de lectura de placas, operaciones que se pueden programar en un flujo de trabajo continuo mediante una automatización inteligente y flexible.

El aislamiento de exosomas mediante ultracentrifugado diferencial es un método eficaz y fiable para el enriquecimiento de alta pureza. El flujo de trabajo en etapas requiere precisión y reproducibilidad extremas, lo que lo convierte en un perfecto candidato a la automatización. Para saber más sobre cómo automatizar su aislamiento y caracterización de exosomas, comience leyendo esta nota de aplicación.

Referencias:
1. Momen-Heravi, F., Balaj, L., Alian, S., Mantel, P-Y., Halleck, A.E., Trachtenberg, A.J., et al. Current methods for the isolation of extracellular vesicles. Biol. Chem. (2013) 394:1253-62. doi: 10.1515/hsz-2013-0141.
2. Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutierrez-Vazquez, C., Sanchez-Madrid, F., and Mittelbrun, M. Sorting it out: Regulation of Exosome Loading. Semin. Cancer Biol. (2014) 28:3-13. doi: 10.1016/j.semcancer.2014.04.009.
3. Van Deun, J., Mestdagh, P., Sormunen, R., Cocquyt, V., Vermaelen, K., Vandesompele, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. J. Extracell. Vesicles. (2014) 3. doi: 10.3402/jev.v3.24858.
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5. Stevanato, L., Thanabalasundraram, L., Vysokov, N., and Sinden, J.D. Investigation of Content, Stoichiometry and Tarnsfer of miRNA from Human Neural Stem Cells Line Derived Exosomes. PLoS One. (2016) 11:e0146353. doi: 10.1371/journal.pone.0146353.
6. San Lucas, F.A., Allenson, K., Bernard, V., Castillo, J., Kim, D.U., Ellis, K., et al. Minimally invasive genomic and transcriptomic profiling of visceral cancers by next-generation sequencing of circulating exosomes. Ann. Oncol. (2016) 27:635-41. doi: 10.1093/annonc/mdv604.
7. Winston, C.N., Goetzl, E.J., Akers, J.C., Carter, B.S., Rockenstein, E.M., Galasko, D., et al. Prediction of conversion from mild cognitive impairment to dementia with neuronally derived blood exosome protein profile. Alzheimers Dement. (Amst). (2016) 3:63-72. doi: 10.1016/j.dadm.2016.04.001.
8. Lasser, C., O-Neil, S.E., Shelke, G.V., Sihlbom, C., Hansson, S.F., Gho, Y.S., et al. Exosomes in the nose induce immune cell trafficking and harbour an altered protein cargo in chronic airway inflammation. J. Transl. Med. (2016) 14:181. doi: 10.1186/s12967-016-0927-4.



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