Desarrollo y producción de vectores víricos: Impulsando el avance para el futuro de la terapia génica

Producción de vectores víricos con el Dr. Johannes van der Loo

Dr. Johannes van der Loo

Durante casi 40 años, parece que la promesa de la terapia génica ha dado repetidamente un paso adelante, seguido de dos pasos atrás.

Gracias a científicos como el Dr. Johannes (Han) van der Loo, eso podría estar a punto de cambiar.

Considerado un pionero en el desarrollo de modelos de producción de vectores víricos, el Dr. van der Loo solo ve un impulso hacia adelante para la terapia génicaen los años venideros. Y no está solo.

Se estima que el tamaño del mercado de la terapia génica para el cáncer fue de 805,5 millones USD en 2015, con una tasa de crecimiento anual compuesto que se prevé que superará el 20 % para 2024.1Los expertos pronostican un mercado de terapia génica en 2025 valorado en 11 000 millones USD.2

Se trata de un crecimiento impresionante para un campo de investigación que, hasta la fecha, ha producido solo cinco terapias que han sido aprobadas para su uso, de las cuales solo una se ha comercializado fuera de Asia (y luego solo en la UE).2

No obstante, el Dr. van der Loo señala que las nuevas terapias génicas se encuentran en las últimas fases de desarrollo y que hay más en preparación en todo el mundo.

Y es el impulso hacia adelante de la terapia génica lo que seguirá motivando importantes investigaciones para el desarrollo de vectores víricos seguros para la entrega de tratamientos que salven vidas en el futuro.

Categorías y tipos de vectores víricos

El Dr. van der Loo explica que los vectores de terapia génica caen en tres categorías básicas:

1. Vectores víricos integradores (p. ej., gammaretrovirus y lentivirus), que se integran en el genoma de la célula objetivo y, por tanto, se replican en células descendientes después de la mitosis.

2. Vectores víricos no integradores (p. ej., adenovirus y virus adenoasociados), que siguen siendo episomales, reduciendo así las posibilidades de oncogénesis.

3. Vectores no víricos, como el ADN plasmático. 

Otros tipos comunes de vectores víricos incluyen el alfavirus, el virus del herpes y el virus vaccinia.

Al elegir un vector viral, según el Dr. van der Loo, primero es importante decidir si se necesita un vector integrador o no integrador.

"Si el objetivo, por ejemplo, es una célula madre hematopoyética que necesita dividirse y dar lugar a una gran progenie", explica, "el vector vírico integrador es la mejor opción porque es necesario impulsar el gen integrado en las células descendientes". Sin embargo, si el tejido consta de células que no se dividen, podemos usar un vector no integrador".

Las consideraciones adicionales incluyen la especificidad del vector vírico, el tipo de células objetivo y los posibles problemas de toxicidad y genotoxicidad.

Desde que en 2002 se descubrió que algunos pacientes tratados con transferencia de genes mediada por vectores gammaretrovíricos desarrollaron leucemia debido a la mutagénesis insercional3, el riesgo de genotoxicidad ha sido una preocupación de seguridad para la terapia génica basada en células. Este riesgo está asociado no solo a los vectores retrovíricos integradores sino también a los vectores no integradores como el AAV.4 Aunque la baja inmunogenicidad del vector AAV no ha causado hasta ahora ningún efecto secundario agudo, en varios ensayos clínicos desencadenó una inmunotoxicidad que podría impedir resultados terapéuticos.5, 6

Por último, es importante tener en cuenta la estabilidad in vitro e in vivo del vector vírico, así como determinar el mejor proceso para producirlo y purificarlo de manera segura. Y es ahí donde entran el Dr. van der Loo y sus asociados.

Comparación de los métodos de producción de vectores víricos

"Hay tres formas básicas de producir vectores víricos: usando una línea celular de empaquetamiento estable, una transfección transitoria o una infección", explica el Dr. van der Loo. "Para la última, me refiero al sistema baculovirus desarrollado por Robert Kotin cuando era investigador en el NIH. En aras de la simplicidad, en este artículo me centraré solo en los otros dos métodos".

Comienza esbozando lo básico: El uso de una línea productora estable incluye los genes Gag/Pol y de envoltura integrados de forma estable, necesarios para fabricar la partícula vírica. Lo que falta es la propia secuencia de vectores, que generalmente se introduce en forma de virus o de plásmido. Debido a que el uso de un plásmido es un método ineficiente para lograr que un vector vírico se integre, generalmente se producen usando un virus.

Posteriormente se cultivan las células, se selecciona un clon y se crea un banco de células maestro de ese clon. Una vez creado y certificado el banco de células maestro, cada vez que las células se descongelen y pongan en cultivo, producirán el vector vírico.

La fabricación con una línea de producción estable es relativamente simple y fácil de escalar. En general, hay poca variabilidad entre lotes, aunque este método es inherentemente menos flexible.

"Después de elegir el vector vírico y la secuencia génica, quedará atrapado", dice el Dr. van der Loo, "porque para cuando seleccione sus clones y haga su banco de células maestro, ya no podrá hacer más cambios".

A diferencia del uso de líneas productoras estables, la transfección transitoria requiere solo tres días, con todos los vectores generados a partir de un único banco de células maestro.

"Por lo tanto, la generación de un lote de vectores es relativamente rápida y extremadamente flexible, ya que se puede cambiar el vector hasta el momento de la fabricación", dice.

La fabricación, sin embargo, es más compleja y difícil de escalar que cuando se utiliza una línea productora estable, y es posible una mayor variabilidad de los lotes si el proceso no se controla adecuadamente. Una razón de ello es que el proceso de transfección transitoria incluye invariablemente la contaminación de plásmidos que se debe eliminar durante la fabricación y la purificación.

Purificación de partículas víricas mediante ultracentrifugación

Un método que el Dr. van der Loo y sus colegas utilizan para purificar las partículas víricas es la ultracentrifugación de gradiente de densidad, que separa eficazmente los viriones llenos de los vacíos. Como solución isoosmótica, se puede utilizar el iodixanol para todas las densidades requeridas por este método.

Dada la naturaleza crítica de las aplicaciones posteriores, el uso de las GMP para la ultracentrifugación es una consideración clave. Es importante reconocer que los tubos y las tapas se suministren como artículos no estériles, y que el método de esterilización (ya sea por rayos gamma, óxido de etileno o calor) puede afectar a la integridad de los tubos.

" Es por eso que siempre consultamos la información de compatibilidad química y esterilización que se proporciona con estos materiales", dice. "Y si este proceso se utiliza para ensayos clínicos de fase posterior, el método debe ser validado".

Él continúa describiendo el proceso básico de purificación que él y sus colegas han utilizado:

"Después de introducir el virus, que tiene la densidad más ligera, ponemos por debajo capas de iodixanol en varias concentraciones", dice, "asegurándonos de que el menisco está justo por debajo de la boquilla del tubo".

" Luego se sella el tubo y, después del centrifugado, el virus se recoge en la banda de 40 % de iodixanol, que está encima de la banda de 54 %. Después de insertar una aguja en la parte superior para romper el vacío, usamos otra aguja para penetrar el costado del tubo para cosechar el virus."

Dado que se trata de un proceso no estéril, señala, es importante higienizar el rotor antes de la ejecución y limpiar el tubo antes de la cosecha del vector. Por último, el Dr. van der Loo aconseja filtrar el producto final con un filtro de al menos 0,2 µm.

También señala que este proceso requiere una formación rigurosa, ya que puede ser tan exigente como eficaz. "Lo usamos para producir con éxito vectores AAV para un ensayo clínico en estadio IIA", dice, "que requirió que realizáramos un total de 480 gradientes de iodixanol".

Retos clínicos para el uso de vectores víricos en terapia génica

La explotación de los complejos procesos moleculares formados durante millones de años de evolución (nuestros y de los virus) no está exenta de desafíos, como lo reconoce el Dr. van der Loo en primer lugar.

"Para empezar, es un tremendo desafío identificar y lograr el nivel apropiado de corrección génica necesario para una enfermedad específica", dice. "Esto incluye el número de copias necesarias, el número de integraciones para integrar los vectores, y el número de células que se pueden transducir".

"En segundo lugar, es importante definir el nivel de expresión del gen terapéutico, que generalmente se ve afectado por la elección del promotor (fuerte o débil) que determina si alcanzamos un nivel de expresión alto o bajo".

"En tercer lugar está el potencial de mutagénesis insercional. Sabemos que los vectores que se integran en el genoma pueden afectar a los genes en el área de integración, y eliminar el potencial de mutagénesis insercional es un desafío continuo".

"Un cuarto desafío es el silenciamiento de los genes, que es una consideración importante para la integración de los vectores, la respuesta inmunitaria a un vector (que afecta la elección de la ruta de administración), el tipo y la pureza del vector y la biodistribución".

"Finalmente, debemos considerar la expresión fuera del objetivo, aunque hemos aprendido que el uso de promotores específicos de tejido puede ayudar a abordar este desafío."

Otras lecciones aprendidas

Después de muchos años de trabajo en el campo de la terapia génica, ¿qué considera el Dr. van der Loo como las lecciones más importantes que ha aprendido?

"Para los ensayos clínicos de la fase inicial, es importante realizar pruebas basadas en el riesgo de todas las materias primas para los criterios de rendimiento críticos y, si es posible, establecer un acuerdo de calidad con todos los proveedores de materiales".

También ha aprendido la importancia de utilizar un proceso de tecnología formalizada al hacer la transición de los procesos del desarrollo a las GMP. "Y nunca subestime el alto nivel de formación técnica que se debe realizar antes de estar listo para la fabricación", señala.

“Por último, invierta en tecnologías escalables para la producción a gran escala. En algunos casos podría considerarse la ultracentrifugación y, para otros, podría tener sentido considerar alternativas como la cromatografía".

Referencias:
1. Disponible en: URL: https://globenewswire.com/news-release/2016/09/13/871431/0/en/Cancer-Gene-Therapy-Market-size-to-exceed-4-3bn-by-2024-Global-Market-Insights-Inc.html.
2. Disponible en: URL: https://www.rootsanalysis.com/reports/view_document/gene-therapy-market-2015-2025/85.html.
3. Hacein-Bey-Abina S, Hauer J, Lim A, et al. Efficacy of gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency. N Engl J Med 2010;363(4):355–364.
4. Kaeppel C, Beattie SG, Fronza R, et al. A largely random AAV integration profile after LPLD gene therapy. Nat Med 2013;19(7):889–891.
5. Masat E, Pavani G, Mingozzi F. Humoral immunity to AAV vectors in gene therapy: challenges and potential solutions. Discov Med 2013;15(85):379–389.
6. Mingozzi F, High KA. Immune responses to AAV vectors: overcoming barriers to successful gene therapy. Blood 2013;122(1): 23–36.