Configuración de compensación para reactivos DURAClone de alto contenido

Introducción

La citometría de flujo de alto continudo debe su elevado valor como método potente en la investigación clínica a la disponibilidad de un menú en expansión de colorantes de tándem que permiten la utilización de un gran número de
parámetros. Sin embargo, la degradación de los colorantes tándem con el tiempo debido a la exposición a la luz y al oxígeno y, finalmente, a las condiciones de almacenamiento inapropiadas, puede afectar gravemente a sus espectros de emisión y puede
resultar en la necesidad de un ajuste de compensación frecuente. Además, puede producirse variabilidad espectral dependiente de la fabricación en los colorantes tándem, que podrían requerir ajustes de compensación específicos por lote.

Con el formato DURAClone, Beckman Coulter Life Sciences introdujo una nueva fórmula de reactivos secos patentada que asegura la estabilidad del fluorocromo a largo plazo mientras se almacena a temperatura ambiente. Como tanto el panel multicolor como sus conjugados de color único correspondientes se proporcionan en este formato seco, unificado y estable, se obtiene un elevado nivel de estandarización en los estudios realizados en múltiples centros y
a lo largo del tiempo. La configuración del instrumento, incluida la compensación precisa y precisa, es fácil y puede ser gestionada por personas que no sean expertas. Los siguientes párrafos describen este procedimiento para Citómetros de flujo Navios así como una comprobación diaria de la configuración del instrumento.

Materiales

Los formatos de tubo seco del panel multicolor y los conjugados de un solo color para los ajustes de PMT y compensación se proporcionan con cada tubo DURAClone. Se requieren los materiales adicionales que se indican en la tabla siguiente: 

  PN RUO/CE-IVD 
 Flow-Check Pro  A69183 / A63493
 Microesferas Flow-Set Pro  A69184 / A63492
 VersaLyse   IM3648 / A09777
 IOTest 3 Fixative Solution (solución de fijación)  IM3515 / A07800
 Esferas VersaComp  B22804 / - 

Método

Tinción de la muestra

Para la tinción de muestras con el cóctel de anticuerpos secos, consulte las instrucciones de uso incluidas en el kit de DURAClone IM.

Tinción de color único para la configuración de compensación:

  1. Pipetee 100 μl de sangre completa en la parte inferior de cada tubo que contenga conjugados de un solo color seco.
  2. Los conjugados de anticuerpos de ECD, PC5.5, PC7, APC-AlexAfluor** 700 y APC-AlexAfluor** 750 son idénticos (coincidentes por lotes) a los conjugados contenidos en los cócteles secos. Tenga en cuenta que estos anticuerpos emparejados por lotes pueden dirigirse contra antígenos débilmente expresados o antígenos que se encuentran en células que se producen solo a baja frecuencia en muestras normales. En estos casos se recomienda añadir 1 gota de microesferas positivas de captura de anticuerpos VersaComp bien mezcladas a la muestra respectiva para introducir una población de microesferas positiva.
  3. Agite cada tubo en vórtex durante 6-8 segundos.
  4. Incúbelos en un lugar oscuro a temperatura ambiente (20-30 ºC) durante 15 minutos.
  5. Añada 2 ml de solución lisante VersaLyse a cada tubo y agite en vórtex a alta velocidad inmediatamente durante 1-3 segundos.
  6. Incube la mezcla a temperatura ambiente durante 15 minutos. Deje los tubos protegidos de la luz.
  7. Centrifugue los tubos a 200 × g durante 5 minutos y deseche el sobrenadante mediante aspiración.
  8. Vuelva a suspender los sedimentos añadiendo 3 ml de PBS a cada tubo.
  9. Centrifugue los tubos a 200 × g durante 5 minutos y deseche el sobrenadante mediante aspiración.
  10. Vuelva a suspender los sedimentos añadiendo 0,5 ml de PBS suplementado con 0,1 % de solución fijadora IOTest3 a cada tubo.
  11. La muestra ahora está lista para la adquisición.

Adquisición de citometría de flujo: Configuración inicial de la aplicación

Ajustes de PMTs

  1. Cree un protocolo de adquisición para el panel multicolor DURAClone respectivo creando un gráfico de dispersión (FS, SS) y gráficos de histograma correspondientes a los canales de interés del detector. Inserte una región de selección en el gráfico de dispersión, seleccione todos los demás histogramas de esta región.
  2. Deseleccione los canales no utilizados en la definición del protocolo (acceda a los parámetros de la pestaña Configuración de adquisición del citómetro).
  3. Guarde el protocolo como “PMT Setting_DURAClone xxx” sutituyendo xxx por el nombre del panel, por ejemplo, “IM B Cell” (Celda B IM).
  4. Ejecute tubos de un solo color para configurar los PMT. Durante cada ciclo con un tubo de color único (considere activar el modo de configuración) en la ficha Configuración de adquisición del citómetro, ajuste la tensión del detector asignado a este color único para obtener una mediana numérica de 0,3 para la población de linfocitos negativos.
  5. Ejecute las microesferas Flow Set-Pro utilizando estos ajustes. Reduzca el discriminador FS para garantizar la visibilidad de la población de microesferas individuales (p. ej., establezca el discriminador FSC a un valor de 10).
  6. Registre los valores de modo X de la población de esferas para cada canal.
  7. Calcule y tome notas en el modo X ± 10 % del valor

Creación de paneles de estandarización automática

Antes de iniciar la creación de paneles de estandarización automática, verifique que todos los colorantes estén definidos correctamente en las “Entradas de colorante personalizado” del menú desplegable Herramientas.

  1. Selección de colorantes
    1. Seleccione “Custom Dye Entries” (Entradas de colorante personalizado) en el menú desplegable “Tools” (Herramientas) (figura 1).

      Figura 1 Configuración de compensación para reactivos DURAClone de alto contenido

      Figure 1

    2. Se abre la siguiente ventana (figura 2).

      Figura 2 Configuración de compensación para reactivos DURAClone de alto contenido

      Figure 2

    3. Si aún no aparecen en la lista, escriba el nombre de los colorantes que faltan en la entrada de nombre de colorante
      1. Seleccione “Add” (Agregar)
      2. Repita el paso para añadir colorantes adicionales
      3. Seleccione “Done” (Listo)
  2. Cree un protocolo de adquisición “DURAClone xxx.pro” sustituyendo xxx por el nombre del panel, por ejemplo, “IM B Cell”. Asegúrese de incluir los gráficos de interés para la aplicación prevista, respectivamente, incluyendo las condiciones de detención adecuadas. Este protocolo puede utilizarse como protocolo de adquisición de datos y como protocolo de verificación en la definición de configuración automática de la aplicación (AutoSetup Configuration).
  3. Definir configuración automática
    1. Seleccione “AutoSetup Application Definition” (Definición de configuración automática de la aplicación) en el menú desplegable “Tools” (Herramientas) (figura 3).

      Figura 3 Configuración de compensación para reactivos DURAClone de alto contenido

      Figure 3

    2. En la ventana siguiente, seleccione los botones “Create a new application definition” (Crear una nueva definición de aplicación) y “Current user only” (Solo usuario actual), y luego seleccione “NEXT” (Siguiente) (figura 4).

      Figura 4 Configuración de compensación para reactivos DURAClone de alto contenido

      Figure 4

    3. Para seleccionar “PMT Setting_DURAClone xxx.PRO” como protocolo base (creado según II.A.3.) para la aplicación, proceda de la siguiente manera:
      1. Examinar: localice la carpeta de protocolo de adquisición y ábrala
      2. Seleccione: “PMT Setting_DURAClone xxxPRO”; ábralo
      3. Verifique que el resumen del protocolo incluye los parámetros adecuados (figura 5):

        Figura 5 Configuración de compensación para reactivos DURAClone de alto contenido

        Figure 5

      4. Seleccione “NEXT” (Siguiente)
      5. Seleccione: Esta aplicación utiliza el bloque de filtros estándar y seleccione “NEXT” (Siguiente) (figura 6).

        Figura 6 Configuración de compensación para reactivos DURAClone de alto contenido

        Figure 6

      6. Seleccione colorantes y/o verifique que se indican los colorantes apropiados, seleccione “NEXT” (Siguiente) (figura 7).

        Figura 7 Configuración de compensación para reactivos DURAClone de alto contenido

        Figure 7

      7. En las ventanas siguientes, deje los objetivos de modo X predeterminados para Flow-Set Pro sin modificar, seleccione “NEXT” (Siguiente) (figura 8).

        Figura 8 Configuración de compensación para reactivos DURAClone de alto contenido

        Figure 8

      8. Introduzca el nombre de la aplicación: “AS DURAClone xxx”, sustituyendo xxx por el nombre del panel, por ejemplo, “IM B Cell” (se recomienda comenzar el nombre con “AS” para ayudar a estructurar el contenido de la carpeta del protocolo) y seleccione “NEXT” (Siguiente) (figura 9).

        Figura 9 Configuración de compensación para reactivos DURAClone de alto contenido

        Figure 9

      9. Compruebe que la casilla “Create a verification Protocol” (Crear protocolo de verificación) no esté marcada (figura 10).

        Figura 10 Configuración de compensación para reactivos DURAClone de alto contenido

        Figure 10

      10. Seleccione “Add additional verifier” (Añadir verificador adicional) y elija el protocolo “DURAClone Verify xxx.PRO” como protocolo de verificación (figura 11).

        Figura 11 Configuración de compensación para reactivos DURAClone de alto contenido

        Figure 11

      11. Seleccione “NEXT” en la siguiente ventana
      12. Seleccione “FINISH” (FINALIZAR) y verifique el informe de definición de la aplicación (figura 12).

        Figura 12 Configuración de compensación para reactivos DURAClone de alto contenido

        Figure 12

  4. Entrada de intervalos objetivo
    1. Abra “AS Duraclone xxx_STAND.pro”
    2. Haga clic con el botón derecho en las regiones lineales de cada uno de los histogramas, seleccione propiedades de región e introduzca los valores de X-Mode (Modo X) calculados ±10 % para cada canal (consulte la sección II.A.7)
    3. Guarde el protocolo

Configuración de compensación

  1. Ejecute el planificador de AutoSetup.
  2. En el menú de la barra de herramientas, seleccione "AutoSetup Scheduler" (Programador de autosetup) (figura 13).

    Figura 13 Configuración de compensación para reactivos DURAClone de alto contenido

    Figure 13

  3. Seleccione la configuración automática “AS DURAClone xxx” y escriba el número de carrusel (figura 14).

    Figura 14 Configuración de compensación para reactivos DURAClone de alto contenido

    Figure 14

  4. Seleccione Schedule (Programar)
  5. Aparecerá la ventana siguiente (figura 15):

    Figura 15 Configuración de compensación para reactivos DURAClone de alto contenido

    Figure 15

  6. Seleccione “Close” (Cerrar) para cerrar la ventana.
  7. La lista de trabajo se crea en la ventana Administrador de aplicaciones, complete la lista de trabajo de la siguiente manera:
    1. Rellene el ID de la muestra 1; este nombre se repetirá para todos los tubos.
    2. Rellene el ID de la muestra 2 siguiendo el orden de los tubos indicados en la columna de protocolo de la lista de trabajo.
      1. Posición 1 Lote FSP
      2. Siguientes posiciones: diferentes tubos de color único
      3. Última posición: Tubo multicolor Duraclone Verify
    3. Añada entre 10 y 20 gotas de microesferas Flow-Set™ Pro en el tubo 1
    4. Utilice el carrusel para cargar los tubos correspondientes.
    5. Ejecute la aplicación
      1. En la ventana “AutoSetup Wizard” (Asistente de configuración automática), desmarque “Automatically approve Steps” (Aprobar automáticamente los pasos)
      2. Marque la casilla “Auto adjust disable” (Desactivar el ajuste automático)
      3. Adquirir sin cambiar voltajes de PMT
      4. Una vez completada la adquisición, haga clic en “Next” (Siguiente)
      5. Ajuste la región de selección en el gráfico de dispersión a la población de linfocitos o a las microesferas de VersaComp
      6. Ajuste la región positiva en el histograma de fluorescencia para centrar únicamente el pico positivo, haga clic en “Next”
      7. Repita los dos pasos anteriores (7.5.5-6) para cada tubo de color individual
      8. Ejecute el tubo de verificación multicolor e inspeccione la plausibilidad de los patrones y poblaciones
      9. Apruebe y guarde los ajustes si puede confirmar la plausibilidad de los patrones de tinción o repita la sección C de la sección 7.3 en caso de que los patrones de tinción no sean plausibles (figura 16).

Figura 16 Configuración de compensación para reactivos DURAClone de alto contenido

Figure 16

Adquisición de citometría de flujo: Uso rutinario

La estabilidad de las señales de salida de PMT se comprobará ejecutando las microesferas Flow-Set Pro antes de su uso rutinario.

  1. Abra el protocolo AS_DURAClonexxx_STAND.pro.
  2. Ejecute (únicamente) las esferas Flow-Set Pro
  3. Una vez finalizada la adquisición, inspeccione las posiciones de los picos
    1. Caso 1: Los objetivos coinciden
      1. Imprima los gráficos y ajustes
      2. Abra el protocolo de adquisición “DURAClone xxx.pro” y ejecute las muestras con ajustes citométricos guardados previamente. Se recomienda crear una lista de trabajo con entradas informativas en las columnas de ID de muestra.
    2. Caso 2: Los objetivos no coinciden
      1. Imprima los gráficos y ajustes
      2. Haga clic en “Rerun” (Volver a ejecutar)
      3. Ajuste los PMT sin coincidencia incrementando los voltajes respectivos en pasos de 5 voltios hasta que los objetivos coincidan
      4. Haga clic en “Acquire” (Adquirir).
      5. Una vez finalizada la adquisición, inspeccione la posición de pico
      6. Si no se cumplen los objetivos, repita los pasos de 3.2.2. a 3.2.5.
      7. Haga clic en “Abort” (Cancelar)
      8. Imprima los gráficos y nuevos ajustes
      9. Abra el protocolo de adquisición “DURAClone xxx.pro”, introduzca los nuevos ajustes de PMT y guarde el protocolo
      10. Procese las muestras. Se recomienda crear una lista de trabajo con entradas informativas en las columnas de ID de muestra.

* Navios está certificado con la marca CE para su uso diagnóstico in vitro con 10 colores. En EE. UU., Navios está previsto para su uso como dispositivo de diagnóstico in vitro para inmunofenotipado con software Navios tetra y reactivos CYTOSTAT tetraCHROME. En los demás casos, es solo para uso en investigación.

** Alexa Fluor es una marca comercial de Molecular Probes, Inc.

DuraClone, Navios, Flow-Set Pro, Beckman Coulter y el logotipo estilizado son marcas comerciales de Beckman Coulter, Inc. y están registradas en la USPTO.

Solo para uso en investigación. No se debe utilizar en procedimientos con fines diagnósticos.