Aislamiento y caracterización de exosomas para análisis y enfoques -ómicos

Ilustración de la investigación en exosomasEl aislamiento de exosomas puede presentar dificultades técnicas a causa de la persistencia durante el proceso de purificación de contaminantes como microvesículas, partículas de lipoproteínas, microorganismos, microsomas, agregados proteicos, así como ADN y otros productos de necrosis.1 Esto hace que sea difícil caracterizar con precisión los exosomas para poderlos usar en análisis y otras aplicaciones posteriores.1 La caracterización de exosomas es importante no solo para comprender sus propiedades y funciones, sino también para identificar proteínas marcadoras exosomales únicas que permitan establecer un método por el cual se pueda evaluar la presencia de exosomas en las muestras. La estandarización de los métodos de aislamiento tiene el potencial de mejorar la cantidad y calidad de los exosomas y de mejorar la reproducibilidad de los resultados obtenidos al emplear preparaciones de exosomas. Si bien los exosomas han atraído la atención por su potencial en el diagnóstico y en el tratamiento, determinar la pureza de las muestras exosomales es una necesidad absoluta antes de poder usar las tecnologías de exosomas en un entorno clínico, ya que las impurezas en las muestras exosomales pueden tener efectos secundarios indeseados. En el contexto del diagnóstico clínico, los contaminantes de la muestra podrían dar lugar a falsos positivos o falsos negativos, induciendo a error en el diagnóstico del paciente.2

Métodos de aislamiento de exosomas

La mayoría de los tipos celulares segregan exosomas, por lo tanto se pueden aislar a partir de cultivos celulares y en los fluidos corporales, como plasma, orina, saliva, suero y líquido cefalorraquídeo.3 Se han elaborado protocolos de aislamiento de exosomas para cada tipo de muestra variando parámetros tales como velocidad de centrifugado, uso de gradientes de filtración y de densidad y otras técnicas.1 El método más empleado para aislar y purificar exosomas de varias procedencias es el ultracentrifugado diferencial,4 en el cual una serie de rotaciones facilitan la reducción por etapas de contaminantes como células muertas, residuos celulares, plaquetas, proteínas y complejos y agregados de ácidos nucleicos así como otros contaminantes del aislado.1 Sin embargo, pueden quedar aún contaminantes no exosomales, como partículas de lipoproteínas, virus y bacterias, microsomas, ADN y productos de necrosis (como cuerpos apoptóticos) y agregados proteicos.

Otras técnicas para aislar exosomas, a menudo usadas junto con el centrifugado diferencial, comprenden el gradiente de densidad de iodixanol, la precipitación, el ultracentrifugado, el aislamiento por inmunoafinidad, la cromatografía de exclusión por tamaño y técnicas microfluídicas.5 Cada método tiene ventajas y desventajas, que deben tenerse en cuenta al seleccionar un método que sea el más indicado para la aplicación posterior. Además, algunos métodos de aislamiento y purificación pueden producir mayor rendimiento proteico, pero dejan las vesículas inviables para ciertas aplicaciones.5 Por ejemplo, se ha visto que la cromatografía de exclusión por tamaño proporciona muestras de alta pureza con relativamente poca contaminación, bajo coste y corto tiempo de procesado; sin embargo, la muestra final puede estar demasiado diluida, solo se puede procesar una muestra a la vez y el proceso puede ser laborioso.5

El contenido no exosomal de una muestra representa una seria dificultad para el análisis de la características de los exosomas, así como para su utilización en estudios y otras aplicaciones.1 Algunos de los contaminantes que pueden ser difíciles de eliminar de las preparaciones de vesículas son partículas de lipoproteínas, microorganismos, microsomas, agregados proteicos, así como ADN y otros productos de necrosis.1 Según cual sea la aplicación posterior de los exosomas purificados, deben realizarse más procedimientos para eliminar contaminantes de la muestra purificada de exosomas. Por ejemplo, se ha demostrado que las preparaciones de exosomas generadas con un gradiente de densidad de iodixanol alcanzan gran pureza, como lo demuestra el enriquecimiento en el marcador exosomal CD63 y la ausencia de proteínas contaminantes, como los complejos extracelulares Argonauta-2.Un método que se usa habitualmente para estimar la cantidad de proteínas contaminantes es el de comparar el cociente entre el recuento de nanovesículas (mediante tecnologías de visualización de vesículas como la plataforma NanoSight) y la concentración de proteínas (obtenida con análisis colorimétricos de proteínas como el análisis BCA).7 La presencia de proteínas contaminantes altera este cociente y por lo tanto se puede aportar una estimación de la pureza de la muestra exosomal. Se ha notificado que muestras con un cociente mayor que 3 x 1010 partículas por µg de proteína, se consideran de alta pureza, mientras que un cociente entre 2 x 109 y 2 x 1010 partículas por µg de proteína se considera de baja pureza.7 Cuando se desarrolle un protocolo de aislamiento, se recomienda que la muestra sea evaluada y optimizada no solo para la presencia de exosomas sino también para la ausencia de elementos contaminantes.

Caracterización de exosomas

Se usan varias estrategias frecuentes para determinar la cantidad y la pureza de los exosomas para proceder a la caracterización de las vesículas tras la purificación.5 El análisis de dispersión de luz dinámica (DLS), cuando se usa junto con el ultracentrifugado analítico, enriquece selectivamente en exosomas dentro de un intervalo de tamaño determinado, basándose en sus signaturas de dispersión de la luz. Puede usarse la espectrometría de masas para identificar la carga proteica de los exosomas y determinar si la muestra contiene agregados proteicos u otros contaminantes.5 La microscopía electrónica puede servir para visualizar la morfología y el tamaño de las vesículas y cuando se usa junto con el marcado inmunológico, características particulares de los exosomas, como las proteínas de superficie.1 La inmunoelectrotransferencia convencional puede detectar la presencia de ciertas proteínas en la muestra, pero no puede determinar la cantidad de exosomas. Otras técnicas que se han utilizado para evaluar la calidad y la cantidad en preparaciones de exosomas son: la microscopía de fuerza atómica, el seguimiento óptico de partículas, la citometría de flujo y los sensores de pulso resistivos.1

Se han identificado algunos marcadores exosomales que se han podido usar para confirmar la presencia de exosomas en preparaciones.8 Marcadores proteicos frecuentes son Alix, TSG101, CD9 y CD63. Otras proteínas que parece que están enriquecidas en los exosomas son DIP2B y miembros de la familia de proteínas 4-transmembrana.2 Sin embargo, no todos los exosomas contienen esas proteínas. La base de datos en línea ExoCarta (http://www.exocarta.org/) es una herramienta que ayuda a los investigadores a identificar y caracterizar cargamentos exosomales. La base de datos contiene proteínas, secuencias de ARN y lípidos que se han identificado en preparaciones exosomales específicas. Finalmente, la identificación de marcadores proteicos para exosomas derivados de tumores, por ejemplo, puede usarse para desarrollar pruebas diagnósticas de tumores en pacientes.
La estandarización del aislamiento y caracterización de exosomas es un paso fundamental para obtener resultados reproducibles de los análisis y otras aplicaciones posteriores, incluidas las aplicaciones clínicas y terapéuticas. La multitud de fuentes de recolección de exosomas, así como la diversidad de técnicas de aislamiento han supuesto muchos obstáculos para la elaboración de protocolos estándar y la obtención de resultados consistentes y reproducibles.Sepa cómo la automatización de los flujos de trabajo puede contribuir a mejorar el aislamiento y la caracterización de exosomas.

Referencias:

1. Witwer KW, Buzás EI, Bemis LT, et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles 2013;2. doi: 10.3402/jev.v2i0.20360.
2. Xu R, Greening DW, Zhu HJ, et al. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. J Clin Invest 2016;126:1152–1162. doi: 10.1172/JCI81129.
3. El Andaloussi S, Mäger I, Breakefield XO, Wood MJA. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nat Rev Drug Discov. 2013;12:347–357. doi: 10.1038/nrd3978.
4. Théry C, Amigorena S, Raposo G, Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. Editor. Board Juan Bonifacino Al (2006) Chapter 3, Unit 3.22. doi: 10.1002/0471143030.cb0322s30.
5. Abramowicz A, Widlak P, Pietrowska M. Proteomic analysis of exosomal cargo: the challenge of high purity vesicle isolation. Mol Biosyst 2016;12:1407–1419. doi: 10.1039/c6mb00082g.
6. Van Deun J, Mestdagh P, Sormunen R, et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. J Extracell Vesicles 2014) 3. doi: 10.3402/jev.v3.24858.
7. Webber J, Clayton A. How pure are your vesicles? J Extracell Vesicles 2013;2. doi: 10.3402/jev.v2i0.19861.
8. Mathivanan S, Simpson RJ. ExoCarta: A compendium of exosomal proteins and RNA. Proteomics 2009;9:4997–5000. doi: 10.1002/pmic.200900351.

 


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