Desarrollo de líneas celulares: selección de coincidencias

Tipo de contenido: Nota de aplicación

Resumen

  • La selección de coincidencias es una necesidad frecuente en muchos flujos de trabajo, incluido el desarrollo de líneas celulares.
  • Los desafíos incluyen:
    • La identificación apropiada de coincidencias/pocillos
    • Reformatear para hacer coincidir la placa
    • Combinar muestras de varias placas
    • El seguimiento de datos sin errores
  • El sistema Span-8 de Biomek, unido al software de seguimiento de datos DART, permite transferencias basadas en datos para la selección de coincidencias garantizando al mismo tiempo la integridad de los datos

La automatización suele considerarse como solución solo cuando se pasa a aplicaciones de alto rendimiento o cuando se ejecutan flujos de trabajo fijos de forma repetida sin ninguna variabilidad. Sin embargo, existen muchos flujos de trabajo que varían de una ejecución a otra que se beneficiarían de la automatización debido a factores como la complejidad, las altas tasas de error y la necesidad de garantizar la integridad de los datos. Un ejemplo común y aparentemente sencillo de un flujo de trabajo de estas características es la selección de coincidencias.

El concepto básico de la selección de coincidencias es simple: 1) identificar las coincidencias en función de los datos del ensayo y 2) consolidar estas coincidencias en un nuevo material de laboratorio de forma identificable. Sin embargo, existen numerosas áreas en las que las cosas pueden salir mal al realizar esta tarea en el banco de pruebas. Primero, se deben volver a asignar los datos del analizador a los pocillos de origen correctos y se deben identificar los pocillos que contienen las coincidencias. Luego, estos pocillos se deben transferir de forma consistente para garantizar que ninguna coincidencia esté mal colocada. Este proceso es aún más complicado al consolidar las coincidencias de múltiples placas de origen y/o al trabajar con placas de pocillos profundos o de poco volumen donde es difícil determinar visualmente la presencia o ausencia de líquido. A pesar de todas estas posibles fuentes de error, hay pocas salvaguardias para realizar esta tarea manualmente.

Aquí describiremos cómo se automatizó la selección de coincidencias como parte de un flujo de trabajo de desarrollo de líneas celulares.
Este flujo de trabajo largo y complejo tuvo múltiples etapas de selección de coincidencias. Después de sembrar células mediante dilución limitante, el ~33 % de los pocillos que recibieron una única célula se identificaron generando imágenes en un dispositivo de obtención de imágenes CloneSelect (Molecular Devices), (Figura 1A, pocillos verdes). Aproximadamente el 50 % de estos pocillos monoclonales mostraron crecimiento después de tres semanas, y estos pocillos de “coincidencia primaria” distribuidos al azar (Figura 1B, contornos rosas) requirieron un muestreo para la titulación de las proteínas.

Automatización Desarrollo de líneas celulares Selección de coincidencias Figura 1

Figura 1. Identificación de coincidencias. A) Tras la dilución limitante, se identificaron los pocillos con una única célula mediante generación de imágenes en un dispositivo de obtención de imagenes CloneSelect (verde/amarillo). B) Las células se cultivaron durante tres semanas y los pocillos con crecimiento de colonias se identificaron mediante generación de imágenes. Los pocillos monoclonales con crecimiento (“coincidencias primarias”) que se ensayaron para titular las proteínas se indican con recuadros rosas.

Utilizamos el receptáculo Span-8 de un Biomek i7 (Figura 2A) para muestrear rápidamente el medio de los pocillos de coincidencia primaria en las cuatro placas de 96 pocillos. Las transferencias fueron dirigidas directamente por los datos de confluencia importados y la capacidad de expansión permitió la obtención simultánea de muestras de múltiples pocillos espaciados por columna para acelerar el proceso (Figura 2B). Además, el sutil nivel de control del pipeteo permitió velocidades de aspiración lentas y una ubicación óptima de la punta para evitar la alteración de las células poco adherentes. El receptáculo Span-8 dispensó pocillos replicados de cada coincidencia primaria en una única placa negra de 384 pocillos, un material de laboratorio dificultoso con el que ejecutar manualmente un proceso de reformateo. Esta placa se analizó luego en un Octet HTX (Pall Forte Bio) para determinar las titulaciones de IgG.

Automatización Desarrollo de líneas celulares Selección de coincidencias Figura 2

Figura 2. Selección de coincidencias automatizada. A) Biomek i7 con filtros HEPA y dispositivos integrados utilizados para el desarrollo de líneas celulares. B) El medio del ~15 % de los pocillos con crecimiento de colonias de una sola célula se muestreó utilizando los pipeteros Span-8 y se transfirió a una placa de pocillos negra inclinada de 384 pocillos para su análisis en el Octet HTX (Pall Forte Bio).

Por muy difíciles que sean los aspectos físicos de la selección de coincidencias, garantizar la integridad de los datos durante un proceso de reformateo es de carácter esencial. En este ejemplo, los datos que se generaron en la placa de ensayo de 384 pocillos deben atribuirse correctamente a los pocillos de origen para poder conducir una segunda etapa de selección de coincidencias. Durante las transferencias de líquidos, Biomek puede transferir automáticamente la información del pocillo de origen (p. ej., la ubicación) a la placa de ensayo. Esto permite al software de datos DART complementario copiar automáticamente los datos del ensayo de la placa de 384 pocillos en las placas y los pocillos fuente (Figura 3A) a fin de evitar la pérdida de datos o los errores de copia/pega. DART no solo proporciona una base de datos de fácil acceso para todos los datos en pantalla (Figura 3B), sino que además los datos se pueden utilizar para impulsar la segunda etapa de selección de coincidencias, que es transferir células de alta expresión a placas de pocillos más grandes para la expansión (“coincidencias secundarias”). La fuente del clon (como el código de barras y el pocillo) o EL ID de seguimiento del clon también se pueden trasladar a medida que se mueven las células para que la placa final tenga información rastreable al origen de las células.

Automatización Desarrollo de líneas celulares Selección de coincidencias Figura 3 

Figura 3. Integridad de los datos durante el reformateo. A) El software DART garantiza la integridad de los datos al automatizar la transferencia de datos desde la placa de ensayo reformateada de vuelta a los pocillos originales. B) Los datos centralizados son accesibles a través de informes (ilustrado) y navegadores web, y la automatización los puede utilizar para establecer etapas basadas en datos adicionales de selección de coincidencias.

Aunque son solo una pequeña parte de un flujo de trabajo de desarrollo de línea celular mayor, las etapas de selección de coincidencias probablemente sean las más proclives a errores al manipular tanto muestras como datos. Hemos demostrado cómo la automatización tanto de las transferencias físicas como de los aspectos de la manipulación de datos de estas etapas de reformateo permite un proceso de selección de coincidencias rápido y sin errores.

 

Las estaciones de trabajo automatizadas Biomek no están destinadas ni se han validado para su uso en el diagnóstico de enfermedades u otras afecciones. Los kits de reactivos genómicos de Beckman Coulter Life Sciences son solo para uso en investigación.

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